使用非放射性铁同位素定量体内通过小鼠胎盘的铁转运

该协议意义重大，因为它使研究人员能够在不需要放射性的情况下跟踪和定量体内铁的分布。由于可以在同一样品中同时检测多种稳定的铁同位素，因此该技术可用于了解来自不同来源的铁的吸收、调节和分布。首先，将 12 个普通盐酸添加到供应商提供的玻璃小瓶中的铁-58 中，然后松散地更换盖子。

要溶解铁，请将溶液在 60 摄氏度下加热一小时。如果仍未溶解，请将溶液在室温下在通风橱中放置过夜以溶解。然后，为了生成氯化铁溶液，通过将溶液加热到60摄氏度并关闭盖子以促进氧化来氧化任何剩余的氯化亚铁。

每50微升溶液加入一微升35%过氧化氢，以进一步促进氧化。将氯化铁溶液留在60摄氏度的罩子中，盖上盖子以蒸发样品。然后用超纯水将氯化铁复溶至100毫摩尔。

根据初始金属重量计算所需的水量。接下来，通过将制备的氯化铁溶液与次氮基三乙酸铁在20毫摩尔碳酸氢钠存在下以1：5摩尔比孵育五分钟，制备一毫升次氮基三乙酸铁。然后将500毫克扑转铁蛋白溶解在4毫升转移和上样缓冲液中，并将4毫升该扑转铁溶液加入15毫升管中制备的硝基三乙酸铁溶液中。

为了最大限度地将次氮基三乙酸铁负载到载转铁蛋白上，请检查溶液是否在pH 7.5，并在必要时用碳酸氢钠或盐酸调节pH值。将混合物在室温下孵育2 1/2小时。接下来，通过将铁-58转铁蛋白溶液转移到分子量截止柱中并离心柱来除去多余的未结合的次氮基三乙酸铁并释放的次氮基三乙酸铁。

离心后，通过加入10毫升转铁蛋白上样缓冲液并离心柱来洗涤色谱柱两次。然后用10毫升盐水洗涤色谱柱并再次离心。最后，使用58微米注射器过滤器对铁-22转铁蛋白溶液进行灭菌，并在4摄氏度下储存直至准备使用。

在盐水中制备每毫升35毫克的铁-58转铁蛋白溶液。然后将麻醉的怀孕小鼠放在加热垫上，缓慢而小心地将铁-58转铁蛋白溶液注射到眶后窦中。注射后六小时，对小鼠实施安乐死，并使用无菌镊子和解剖剪刀小心地取出子宫。

切断胎儿胎盘单位，包括单个胎儿和胎盘，胎盘在被子宫的一部分包围的羊膜袋中。接下来，小心地切开子宫和羊膜囊，不要打扰胎儿和胎盘。然后剥开羊膜囊，取出胎儿和胎盘。

切断脐带后，用干净的任务擦拭将胎儿和胎盘吸干，以去除多余的羊水，并记录整个胎盘的重量。用剃须刀片将每个胎盘切成两半。将每一半放入两毫升的试管中，并在液氮中快速冷冻。

为了收集胚胎肝脏，牺牲胚胎，并固定胚胎以稳定，使腹部暴露在外。使用解剖剪刀在连接脐带的地方做一个小切口。将解剖剪刀的一端插入切口，并向冠状平面进行 1/4 英寸的正中平面切割。

然后进行横向平面切割以暴露胎儿肝脏。用镊子取出胎肝，记录整个胚胎肝的重量。将整个胚胎肝脏放入两毫升管中，并在液氮中快速冷冻。

将组织无限期地存放在零下 80 摄氏度。为了量化胎盘和胎肝中的非血红素铁，解冻胎盘两半和整个胎肝。然后称量胎盘的两半。

向组织样品中加入400微升蛋白质沉淀溶液，并使用电动均质器均质组织。将样品在 100 摄氏度下孵育一小时。然后在室温水中冷却两分钟。

打开盖子以释放压力。然后再次关闭试管。离心样品以沉淀组织碎片后，小心地将上清液转移到新的标记管中进行ICP-MS分析。

接下来要定量血红素铁，记录离心后获得的沉淀的重量。然后将沉淀在10毫升浓70%硝酸中消化，并补充1毫升30%过氧化氢。将样品加热至200摄氏度15分钟，然后送去进行ICP-MS分析。

ICP-MS测量允许检测两种不同的铁同位素。最丰富的铁同位素铁-56反映了组织中的慢性离子变化。另一种同位素铁-58反映了注入铁分布的急剧变化。

铁-56测量证实，与铁饱孕相比，缺铁妊娠的胚胎肝脏减少了铁储备。Iron-58测量证实，在缺铁妊娠中，与铁充足的妊娠相比，在六小时内转移到胚胎肝脏的铁更少。在执行该程序时，请记住记录组织的重量。

这些重量对于计算铁浓度是必需的。由于 iron-58 不需要特殊的处理预防措施和处置，因此未处理的组织可用于其他分析，包括但不限于蛋白质印迹或 qPCR。