该协议描述了如何使用微生理系统在体外评估药物诱导的肝损伤，该系统可以维持高功能和代谢活跃的肝脏微组织长达四周。这种方法是一种人类特异性细胞培养模型，可准确检测药物诱导的新型化合物肝损伤责任，比简单的2D培养甚至更复杂的3D培养更具预测性。该技术可用作一系列临床前安全性测试的一部分，以确定化合物是否可以安全开始临床开发。
可以测试多种模式。通过将控制器连接到细胞培养箱中的扩展坞室来开始设置肝脏微生理系统。确保将新鲜干燥剂添加到位于控制器背面的干燥剂罐中。
按下船摇杆开关打开控制器后，等待五分钟，让系统稳定并达到压力。从包装中取出每个盘子。接下来，通过在储层侧添加 500 微升预热播种高级 DMEM 培养基来灌注每口井。
将驱动程序放在培养箱中的扩展坞上。完成后，在控制器屏幕上选择主程序，直到流体通过过滤器支架。为了覆盖表面通道，用1.1毫升播种高级DMEM培养基填充所有孔。
将带有板的驱动器放入 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的培养箱中后，连接扩展坞并运行孵化程序。通过将PHHs和HJCs的小瓶保持在37摄氏度的水浴中解冻，直到只剩下一小块冰。解冻后，轻轻移取最多两瓶PHH直接移入预热的冷冻保存肝细胞恢复培养基CHRM培养基的管中。
然后使用一毫升CHRM从冷冻管中洗涤剩余的细胞。将HKC从冷冻管中轻轻移液到50毫升离心管中的10毫升冰冷种子高级DMEM培养基中。之后，在室温下以100倍G分别离心两种细胞类型10分钟。
离心后，除去上清液并将PHH重新悬浮在温热接种的高级DMEM培养基中，将HKCs重悬于冰冷的接种高级DMEM培养基中，每瓶添加到管中的细胞使用一毫升。用轻柔的摇晃动作重新悬浮细胞，然后放在冰上。悬浮时，计数细胞并记录活力。
细胞活力必须高于85%接下来，断开驱动器与扩展坞的连接，并将驱动器放入微生物安全柜或MBSC。然后将培养基从支架上方吸出到停止点、通道和储液器，在培养孔中留下 0.2 毫升的死体积，到达支架上方。将 400 微升播种高级 DMEM 培养基加入井室，然后将驱动器放回培养箱中的扩展坞，并运行培养基更换程序三分钟。
三分钟后，断开驱动程序与坞站的连接，然后将驱动程序放回 MBSC。将培养基从上述支架吸出到停止点和每个孔的储库端，然后通过轻轻摇动管重新悬浮PHH，并将所需体积的细胞悬液添加到每个培养孔中。小心地移液细胞悬浮液，确保细胞均匀分散在板支架上。
小心地重新悬浮HKC，并将细胞悬浮液添加到每个培养孔中。一旦所有孔都包含两种细胞类型，将微生理系统或MPS驱动器放在培养箱中的扩展坞上，而无需物理连接以静置一小时。一小时后，将驱动程序连接到坞站并运行种子程序。
当程序在两分钟时自动暂停时，从培养箱中取出驱动程序，然后缓慢向通道中加入 1， 000 微升播种高级 DMEM 培养基，以达到 1.4 毫升的总体积。之后，将板移动到培养箱中，并运行种子程序的其余部分八个小时。第四天，暂停控制器上的程序，然后断开驱动器和板与扩展坞的连接。
将它们转移到 MBSC。使用移液管从每个孔中手动收集约1毫升培养基进行可溶性生物标志物分析，而不会通过触摸支架干扰细胞培养。将收集的培养基标记为第四天样品，并运行乳酸脱氢酶和尿素测定作为质量控制检查，以确保接种成功。
接下来，通过执行培养基更换根据板计划给每个孔加样。完成后，将驱动程序返回到孵化器中的扩展坞上，然后运行孵化程序。第六天，断开驱动器和车牌与扩展坞的连接，然后转移到 MBSC。
使用移液管从每个孔中收集约1毫升培养基，并标记为给药后48小时样品并将样品储存在零下80摄氏度以备日后测定。在第八天，使用一对镊子从板上取出支架，并将支架放置在含有500微升DPBS的24孔板中，每孔中不含钙和镁，而不会干扰微观组织。在倒置光学显微镜下以10倍放大倍率拍摄每个支架的快照。
在第四天，在给药之前，通过LDH释放和尿素合成对形成的肝脏微组织进行质量控制检查。在第八天，评估多种健康和肝脏指标，如白蛋白，尿素，CYP三A四，ATP，以确认微组织中高水平的肝功能和可重复性。造影相显微镜和肝脏微组织中的IF染色显示HKCs在PHH微组织中的均匀分布。
肝脏微组织急性暴露于曲格列酮引起毒性，由丙氨酸氨基转移酶或ALT检测到，LDH释放以及白蛋白和尿素产量的迅速减少。ATP含量和CYP三A四活性证实了曲格列酮引起的毒性，EC50值与其他终点高度相当。在MPS中培养八天后拍摄的明场显微镜图像显示健康的肝脏微组织，均匀地接种在载体对照中的支架上。
在用阳性对照和曲格列酮处理的重复中观察到组织死亡或降解。此外，还研究了暴露于吡格列酮后的肝毒性。未检测到LDH或ALT释放，但是，48小时后观察到白蛋白和尿素产量轻度减少。
在高吡格列酮浓度下观察到ATP含量略有降低。EC50值由剂量反应曲线生成。显微镜检查显示，在两种最高测试浓度下暴露于吡格列酮96小时后，微组织发生了轻微的改变。
在这项研究中，使用具有良好质量和活力超过85%的细胞对于在微生理系统中产生高度功能性和健康的3D微组织至关重要。按照该程序，我们可以评估腺嘌呤和药物相互作用以及药物诱导的肝损伤在疾病模型上，例如使用肝实质和非实质细胞三重培养的非酒精性Delta肝炎或非酒精性脂肪性肝病模型。
