El protocolo describe cómo evaluar la lesión hepática inducida por fármacos in vitro utilizando un sistema microfisiológico que puede mantener microtejidos hepáticos altamente funcionales y metabólicamente activos durante un máximo de cuatro semanas. Este enfoque es un modelo de cultivo celular específico para humanos para detectar con precisión la responsabilidad de lesión hepática inducida por fármacos para nuevos compuestos, que es más predictivo que los cultivos 2D más simples o incluso los cultivos 3D más complejos. Esta técnica se puede utilizar como parte de una batería de pruebas de seguridad preclínicas para determinar si un compuesto es seguro para comenzar el desarrollo clínico.
Se puede probar una amplia variedad de modalidades. Comience a configurar el sistema microfisiológico hepático conectando el controlador a la estación de acoplamiento en una incubadora de cultivo celular. Asegúrese de agregar desecante nuevo al frasco de desecante ubicado en la parte posterior del controlador.
Después de encender el controlador presionando el interruptor basculante del barco, espere cinco minutos para que el sistema se estabilice y alcance la presión. Retire cada plato del embalaje. A continuación, prepare cada pocillo agregando 500 microlitros de medio DMEM avanzado de siembra precalentado al lado del depósito.
Coloque el conductor en la estación de acoplamiento de la incubadora. Cuando haya terminado, seleccione el programa principal en la pantalla del controlador hasta que el fluido pase por los soportes del filtro. Para cubrir el canal de superficie, llene todos los pozos con 1.1 mililitros de medio DMEM avanzado de siembra.
Después de colocar los controladores con placas en una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono, conecte la estación de acoplamiento y ejecute el programa de incubación. Descongele los viales de PHH y HJC manteniendo los viales en un baño de agua de 37 grados centígrados hasta que solo quede una pequeña astilla de hielo. Una vez descongelado, pipetear suavemente un máximo de dos viales de PHH directamente en un tubo de medio de recuperación de hepatocitos criopreservados precalentado, medios CHRM.
Luego use un mililitro de CHRM para lavar las células restantes del criotubo. Pipetear los HKC suavemente desde el criotubo a 10 mililitros de medio DMEM avanzado de siembra en frío en un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Más tarde, centrifugar ambos tipos de células por separado a temperatura ambiente a 100 veces G durante 10 minutos.
Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender los PHH en medio DMEM avanzado de siembra en caliente y HKC en medio DMEM avanzado de siembra helada utilizando un mililitro por vial de las células agregadas al tubo. Vuelva a suspender las células con una acción de balanceo suave y luego colóquelas en hielo. Cuando esté suspendido, cuente las celdas y registre la viabilidad.
La viabilidad de la celda debe ser superior al 85%A continuación, desconecte el controlador de la estación de acoplamiento y coloque el controlador en el gabinete de seguridad microbiológica o MBSC. Luego aspire el medio desde arriba del andamio hasta el punto de parada, el canal y el depósito, dejando un volumen muerto de 0,2 mililitros en el pozo de cultivo, llegando justo por encima del andamio. Agregue 400 microlitros de medio DMEM avanzado de siembra en la cámara del pozo antes de devolver el controlador a la estación de acoplamiento en la incubadora y ejecutar el programa de cambio de medios durante tres minutos.
Después de tres minutos, desconecte el controlador de la estación de acoplamiento y vuelva a colocarlo en el MBSC. Aspirar los medios desde el andamio anterior hasta el punto de parada y en el extremo del depósito de cada pocillo, seguido de volver a suspender los PHH balanceando suavemente el tubo y agregando el volumen requerido de la suspensión celular a cada pocillo de cultivo. Pipetea cuidadosamente la suspensión celular, asegurando una dispersión uniforme de las células a través del andamio de la placa.
Vuelva a suspender cuidadosamente los HKC y agregue bien las suspensiones celulares a cada cultivo. Una vez que todos los pocillos contengan ambos tipos de células, coloque el sistema microfisiológico o el controlador MPS en la estación de acoplamiento en la incubadora sin conectarse físicamente para reposar durante una hora. Una vez que haya pasado una hora, conecte el controlador a la estación de acoplamiento y ejecute el programa de semillas.
Cuando el programa se detenga automáticamente a los dos minutos, retire el controlador de la incubadora y agregue lentamente 1, 000 microlitros del medio DMEM avanzado de siembra al canal para lograr un volumen total de 1.4 mililitros. Más tarde, mueva las placas a la incubadora y ejecute el resto del programa de semillas durante ocho horas. En el cuarto día, pausa el programa en el controlador y desconecta el controlador y la placa de la estación de acoplamiento.
Transfiéralos a un MBSC. Utilice una pipeta para recoger manualmente aproximadamente un mililitro de medio de cada pocillo para el análisis de biomarcadores solubles sin alterar el cultivo celular tocando el andamio. Etiquete los medios recolectados como muestras del día cuatro y ejecute ensayos de lactato deshidrogenasa y urea como control de calidad para garantizar que la siembra haya sido exitosa.
A continuación, dosifique cada pocillo de acuerdo con el plan de la placa realizando el cambio de medios. Una vez completado, devuelva el controlador a la estación de acoplamiento en la incubadora y ejecute el programa de incubación. En el sexto día, desconecte el conductor y la placa de la estación de acoplamiento y transfiéralos a un MBSC.
Use una pipeta para recolectar aproximadamente un mililitro de medio de cada pocillo, y etiquételo como muestras 48 horas después de la dosis y almacene las muestras a menos 80 grados centígrados para ensayos posteriores. En el octavo día, retire los andamios de las placas con un par de pinzas y coloque los andamios en una placa de 24 pocillos que contenga 500 microlitros de DPBS sin calcio y magnesio en cada pocillo sin alterar el microtejido. Tome las instantáneas de cada andamio bajo un microscopio de luz invertida con un aumento de 10 veces.
En el cuarto día, antes de la dosificación del fármaco, se realizó un control de calidad de los microtejidos hepáticos formados con liberación de LDH y síntesis de urea. En el día ocho, se evaluaron múltiples métricas de salud y hepáticas como albúmina, urea, CYP tres A cuatro, ATP para confirmar altos niveles de funcionalidad hepática y reproducibilidad en los microtejidos. La microscopía de fase de contraste y la tinción de IF en los microtejidos hepáticos revelaron la distribución uniforme de HKC en los microtejidos PHH.
La exposición aguda de los microtejidos hepáticos a la troglitazona causó toxicidad, que fue detectada por la alanina aminotransferasa o ALT, y la liberación de LDH y una rápida reducción en la producción de albúmina y urea. El contenido de ATP y la actividad de CYP tres A cuatro confirmaron la toxicidad causada por troglitazona, y los valores de EC50 fueron altamente comparables a otros criterios de valoración. Las imágenes de microscopía de campo claro tomadas después de ocho días de cultivo en el MPS revelan un microtejido hepático sano, sembrado uniformemente en todo el andamio en el control del vehículo.
Se observó muerte o degradación tisular en las réplicas tratadas con control positivo y troglitazona. Además, también se investigó la toxicidad hepática después de la exposición a pioglitazona. No se detectó liberación de LDH o ALT, sin embargo, se observó una leve reducción en la producción de albúmina y urea después de 48 horas.
Se observó una reducción menor en el contenido de ATP a altas concentraciones de pioglitazona. Los valores de EC50 se generaron a partir de las curvas de dosis-respuesta. La microscopía reveló una ligera alteración del microtejido después de 96 horas de exposición a pioglitazona en las dos concentraciones más altas probadas.
En el estudio, el uso de células de buena calidad y viabilidad superiores al 85% es esencial para generar microtejidos 3D altamente funcionales y sanos en el sistema microfisiológico. Después de este procedimiento, podemos evaluar la adenina y las interacciones farmacológicas y la lesión hepática inducida por fármacos en modelos de enfermedad como la hepatitis Delta no alcohólica o el modelo de enfermedad del hígado graso no alcohólico que utiliza el cultivo triple de células del parénquima hepático y no parenquimatoso.
