O protocolo descreve como avaliar a lesão hepática induzida por drogas in vitro usando um sistema microfisiológico que pode manter microtecidos hepáticos altamente funcionais e metabolicamente ativos por até quatro semanas. Esta abordagem é um modelo de cultura celular específico para humanos para detectar com precisão a responsabilidade de lesão hepática induzida por drogas para novos compostos, o que é mais preditivo do que culturas 2D mais simples ou culturas 3D ainda mais complexas. Esta técnica pode ser usada como parte de uma bateria de testes de segurança pré-clínicos para determinar se um composto é seguro para iniciar o desenvolvimento clínico.
Uma grande variedade de modalidades pode ser testada. Comece a configurar o sistema microfisiológico do fígado conectando o controlador à casa da estação de ancoragem em uma incubadora de cultura de células. Certifique-se de que o dessecante fresco seja adicionado ao frasco dessecante localizado na parte de trás do controlador.
Depois de ligar o controlador pressionando o interruptor do balancim do barco, aguarde cinco minutos para que o sistema se estabilize e atinja a pressão. Retire cada placa da embalagem. Em seguida, prepare cada poço adicionando 500 microlitros de meio DMEM avançado de semeadura pré-aquecida ao lado do reservatório.
Coloque o motorista na estação de ancoragem na incubadora. Quando terminar, selecione o programa principal na tela do controlador até que o fluido passe pelos suportes do filtro. Para cobrir o canal de superfície, encha todos os poços com 1,1 mililitros de meio DMEM avançado de semeadura.
Depois de colocar os drivers com placas em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, conecte a estação de ancoragem e execute o programa de incubação. Descongele frascos para injetáveis de PHHs e HJCs segurando os frascos em banho-maria de 37 graus Celsius até que apenas uma pequena lasca de gelo permaneça. Uma vez descongelado, pipete suavemente um máximo de dois frascos para injetáveis de PHHs diretamente para um tubo de meio de recuperação de hepatócitos criopreservados pré-aquecidos, meio CHRM.
Em seguida, use um mililitro de CHRM para lavar as células restantes do criotubo. Pipetar os HKCs suavemente do criotubo em 10 mililitros de meio DMEM avançado de semeadura a frio gelado em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Mais tarde, centrifugar ambos os tipos de células separadamente à temperatura ambiente a 100 vezes G por 10 minutos.
Após a centrifugação, remova o sobrenadante e ressuspeite os PHHs em meio DMEM avançado de semeadura a quente e HKCs em meio DMEM avançado de semeadura a frio usando um mililitro por frasco para injetáveis das células adicionadas ao tubo. Ressuspeite as células com uma ação suave de balanço e, em seguida, coloque no gelo. Quando suspenso, conte as células e registre a viabilidade.
A viabilidade da célula deve ser superior a 85%Em seguida, desconecte o motorista da estação de ancoragem e coloque-o no gabinete de segurança microbiológica ou MBSC. Em seguida, aspirar o meio de cima do andaime para o ponto de parada, canal e reservatório, deixando um volume morto de 0,2 mililitros no poço de cultura, alcançando logo acima do andaime. Adicione 400 microlitros de meio DMEM avançado de semeadura na câmara do poço antes de devolver o driver à estação de ancoragem na incubadora e executar o programa de troca de mídia por três minutos.
Após três minutos, desconecte o driver da estação de encaixe e coloque-o novamente no MBSC. Aspirar o meio do andaime acima até o ponto de parada e na extremidade do reservatório de cada poço, seguido de ressuspensão dos PHHs balançando suavemente o tubo e adicionando o volume necessário da suspensão celular a cada poço de cultura. Pipete cuidadosamente a suspensão celular, garantindo uma dispersão uniforme das células através do andaime da placa.
Ressuspeite cuidadosamente os HKCs e adicione bem as suspensões celulares a cada cultura. Uma vez que todos os poços contenham ambos os tipos de células, coloque o sistema microfisiológico ou o driver MPS na estação de ancoragem na incubadora sem se conectar fisicamente para ficar em pé por uma hora. Uma vez que uma hora se passou, conecte o driver à estação de ancoragem e execute o programa de sementes.
Quando o programa pausar automaticamente em dois minutos, remova o driver da incubadora e adicione lentamente 1.000 microlitros do meio DMEM avançado de semeadura ao canal para atingir um volume total de 1,4 mililitros. Mais tarde, mova as placas para a incubadora e execute o resto do programa de sementes por oito horas. No quarto dia, pause o programa no controlador e desconecte o driver e a placa da estação de encaixe.
Transfira-os para um MBSC. Use uma pipeta para coletar manualmente aproximadamente um mililitro de meio de cada poço para análise de biomarcadores solúveis sem perturbar a cultura celular tocando no andaime. Rotule o meio coletado como amostras do quarto dia e execute ensaios de lactato desidrogenase e ureia como verificação de controle de qualidade para garantir que a semeadura tenha sido bem-sucedida.
Em seguida, dose cada poço de acordo com o plano de placas, realizando a troca de mídia. Uma vez concluído, devolva o motorista à estação de ancoragem na incubadora e execute o programa de incubação. No sexto dia, desconecte o motorista e a placa da estação de encaixe e transfira para um MBSC.
Use uma pipeta para coletar aproximadamente um mililitro de mídia de cada poço e rotule como amostras de dose de 48 horas após e armazene as amostras a menos 80 graus Celsius para ensaios posteriores. No oitavo dia, retire os andaimes das placas usando um par de pinças e coloque os andaimes em uma placa de 24 poços contendo 500 microlitros de DPBS sem cálcio e magnésio em cada poço sem perturbar o microtecido. Tire as fotos de cada andaime sob um microscópio de luz invertida com 10 vezes a ampliação.
No quarto dia, antes da dosagem do medicamento, foi realizada uma verificação de controle de qualidade dos microtecidos hepáticos formados com liberação de LDH e síntese de ureia. No oitavo dia, múltiplas métricas de saúde e hepáticas, como albumina, ureia, CYP três A quatro, ATP foram avaliadas para confirmar altos níveis de funcionalidade hepática e reprodutibilidade nos microtecidos. A microscopia de fase de contraste e a coloração de FI nos microtecidos hepáticos revelaram a distribuição uniforme de HKCs nos microtecidos de HPH.
A exposição aguda dos microtecidos hepáticos à troglitazona causou toxicidade, que foi detectada pela alanina aminotransferase ou ALT, e liberação de LDH e uma rápida redução na produção de albumina e ureia. O teor de ATP e a atividade de CYP três A quatro confirmaram a toxicidade causada pela troglitazona, e os valores de CE50 foram altamente comparáveis a outros desfechos. As imagens de microscopia de campo brilhante tiradas após oito dias de cultura no MPS revelam um microtecido hepático saudável, uniformemente semeado em todo o andaime no controle do veículo.
Morte ou degradação tecidual foi observada nas repetições tratadas com controle positivo e troglitazona. Além disso, a toxicidade hepática após a exposição à pioglitazona também foi investigada. Nenhuma liberação de LDH ou ALT foi detectada, no entanto, uma leve redução na produção de albumina e ureia foi observada após 48 horas.
Uma pequena redução no teor de ATP foi observada em altas concentrações de pioglitazona. Os valores de CE50 foram gerados a partir das curvas dose-resposta. A microscopia revelou ligeira alteração microtecidual após 96 horas de exposição à pioglitazona nas duas maiores concentrações testadas.
No estudo, o uso de células com boa qualidade e viabilidade acima de 85% é essencial para a geração de microtecidos 3D altamente funcionais e saudáveis no sistema microfisiológico. Após este procedimento, podemos avaliar a adenina e as interações medicamentosas e a lesão hepática induzida por drogas em modelos de doenças, como hepatite delta não alcoólica ou modelo de doença hepática gordurosa não alcoólica que usa cultura tripla de células parenquimatosas e não parenquimatosas hepáticas.
