我们的实验方案为研究复制如何在受损DNA上发生开辟了新的可能性。这些技术可以检测与DNA病变相反的单链DNA间隙的形成和修复。S1核酸酶切割单链DNA并允许检测复制后间隙。
这种方法最初由Meneghini博士和Cordiero-Stone博士于20世纪70年代在巴西使用，最近由我们应用于DNA纤维测定。使用这里描述的技术来研究复制后间隙的形成和修复，可以为DNA修复和复制应激反应的机制提供见解，从而保持基因组完整性。对于此处描述的两种方案，S1光纤和间隙填充测定，包括所有对照以确保准确解释数据至关重要。
该程序将由我们实验室的博士生Davi J.Martins和Annabel Quinet博士演示，后者之前在我们小组工作时开发了这些技术。首先，吸出培养基，并立即将具有20微摩尔IDU培养基的培养基加入细胞中。将细胞在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育20分钟。
然后，用预热的PBS快速洗涤细胞两次，并用每平方米20焦耳的UV-C照射它们。使用未经处理的细胞作为对照。立即将含有200微摩尔CldU的培养基加入细胞中，并在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育60分钟。
之后，用预热的PBS洗涤细胞两次，并根据室温下的细胞系用CSK 100缓冲液透化它们2至10分钟。CSK通透后，与通透之前相比，几乎看不到细胞质的细胞核。小心地将PBS倒入每个孔的侧面，用PBS洗涤细胞核。
然后，用S1缓冲液洗涤细胞核。将细胞核在S1缓冲液中用每毫升20个单位的S1核酸酶孵育，并且没有S1核酸酶，在37摄氏度下孵育30分钟。接下来，吸出S1缓冲液并在PBS中加入0.1%BSA。
刮取细胞核并将其转移到大约注释的1.5毫升管中。始终将管子放在冰上。将细胞核以约4， 600倍G在4摄氏度下离心5分钟。
以每微升约1， 500个细胞的浓度重悬于PBS中的沉淀。将试管放在冰上，并通过铺展方案立即进行DNA纤维制备。用碳铅笔注释显微镜载玻片，并将其平放在托盘上。
点击管的底部以确保均质化，并在相应的载玻片顶部添加两微升细胞。加入六微升裂解缓冲液，并通过上下移液约五次来裂解细胞。使用移液器尖端将液滴稍微拉向载玻片底部，并在室温下孵育五分钟以裂解细胞核。
将滑块倾斜约20至40度，并允许液滴以恒定的低速扩散到滑块的底部。让载玻片在室温下在黑暗中干燥10至15分钟。然后，将它们浸入装有新鲜制备的固定溶液的罐中，并在室温下孵育五分钟，以将DNA固定在载玻片上。
用PBS洗涤载玻片两次，持续5分钟，并在室温下用新鲜制备的2.5臼齿氯酸使DNA变性40至60分钟。用PBS洗涤载玻片三次，持续五分钟，并用5%BSA阻止先前在37摄氏度下加热30至60分钟。轻轻拍打纸张以从载玻片中取出多余的液体。
向载玻片滴加30微升一抗，并在顶部放置盖玻片。在室温下在黑暗潮湿的室中孵育1至1.5小时。将载玻片放入装有PBS的罐子中一到两分钟，然后小心地取下盖玻片。
用PBST在罐子中洗涤三次，持续五分钟，然后将载玻片放入PBS中。轻轻敲击纸张以除去多余的液体，并向载玻片滴加30微升二抗。在上面放一个盖玻片。
在室温下在黑暗潮湿的室中孵育45至60分钟。重复洗涤载玻片的步骤，再次去除多余的PBS，并向载玻片滴加20微升的安装试剂。在上面放一个盖玻片，避免气泡。
在滑轨顶部附近放置一滴浸油，其中细胞被裂解。使用绿色通道并搜索背景中的绿色点以查找焦点。打开徕卡应用套件软件，单击“获取”，然后选择绿色通道。
在分析之前调整绿色通道的设置。然后，更改为红色通道并调整设置。找到纤维的主要浓度，然后移动到边缘，以找到均匀分布的，不重叠的单个纤维。
仅使用一个通道来选择图片的区域，并避免潜在的偏差。单击“获取叠加层”图标，然后调整软件以获得正确的显微镜放大倍率。每张幻灯片在绿色通道处拍摄大约15到20张照片，同时在整张幻灯片旁边拍摄，然后在红色通道上拍摄。
现在，两个通道已合并，创建的叠加层将移动到唯一的文件夹中。可以看到带有红色和绿色的纤维。打开 ImageJ 软件，左键单击第五个图标，选择第二个选项，然后选择分割线工具。
单击鼠标左键可绘制红色或绿色区域的确切路径，单击鼠标右键可停止绘制。按下键盘上的 M 按钮以测量长度。对于 S1 光纤，请跟踪每根光纤的红色和绿色区域测量值，并从不同图片中测量至少 150 根光纤的红色和绿色区域长度。
S1光纤显示在这些代表性图像中。这里显示了没有间隙且不受S1核酸酶切割影响的对照新生DNA束。DNA束阳性的间隙被S1核酸酶切割，导致CldU束长度较短。
可以执行文本手稿中广泛描述的差异标记方案来标记间隙填充事件。在该测定中，称为间隙填充测定，具有至少一个CldU贴片或更少CldU贴片的较长IDU轨迹对应于低间隙填充密度。较短的 IDU 束（至少具有一个 CldU 贴片）和较长的 IDU 束（具有较多的 CldU 贴片）对应于高间隙填充密度。
该方案的透化步骤对于S1核酸酶作用于复制受损DNA期间形成的间隙至关重要。S1核酸酶也可用于彗星测定方案，以检测在复制治疗后仍然存在的受损DNA期间形成的间隙。S1纤维测定为复制后间隙可能导致癌症脆弱性的新范式铺平了道路，特别是在携带BRCA1和2基因突变的乳腺癌和卵巢癌中。
