우리의 프로토콜은 손상된 DNA에서 복제가 어떻게 발생하는지 조사 할 수있는 새로운 가능성을 열어줍니다. 이 기술은 DNA 병변 반대편에있는 단일 가닥 DNA 갭의 형성과 복구를 감지 할 수 있습니다. S1 뉴클레아제는 단일 가닥 DNA를 절단하고 복제 후 갭을 검출할 수 있습니다.
이 접근법은 브라질에서 1970 년대에 Meneghini 박사와 Cordiero-Stone 박사에 의해 처음 사용되었으며 최근에는 DNA 섬유 분석에 적용되었습니다. 복제 후 갭의 형성 및 복구를 연구하기 위해 여기에 설명 된 기술을 사용하면 게놈 무결성을 유지하는 DNA 복구 및 복제 스트레스 반응의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 여기에 설명된 두 프로토콜, S1 파이버 및 갭 필링 분석의 경우, 데이터의 정확한 해석을 보장하기 위해 모든 컨트롤을 포함하는 것이 중요합니다.
이 절차는 우리 실험실의 박사 과정 학생 인 Davi J.Martins와 우리 그룹에서 일할 때 이전에 이러한 기술을 개발 한 공동 작업자 인 Annabel Quinone 박사가 시연합니다. 우선, 배양 배지를 흡인하고, 즉시 20-마이크로몰의 IDU 배지를 갖는 배양 배지를 세포에 첨가한다. 세포를 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 정확하게 20 분 동안 배양하십시오.
그런 다음, 미리 가온된 PBS로 세포를 두 번 신속하게 세척하고 미터 평방 UV-C 당 20 줄로 조사한다. 처리되지 않은 세포를 대조군으로 사용하십시오. 즉시 200 마이크로 몰의 CldU가있는 배지를 세포에 첨가하고 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 정확하게 60 분 동안 배양하십시오.
그 후, 세포를 미리 가온된 PBS로 두 번 세척하고, 실온에서 세포주에 따라 2 내지 10분 동안 CSK 100 완충액으로 이들을 투과시킨다. CSK 투과화 후, 세포질이 거의 없는 핵은 투과 전의 핵과 비교하여 볼 수 있다. PBS를 각 웰의 측면 아래로 조심스럽게 부어 PBS로 핵을 세척한다.
그런 다음 핵을 S1 버퍼로 세척하십시오. S1 버퍼 내의 핵을 밀리리터 S1 핵클레아제 당 20 유닛으로 인큐베이션하고, S1 뉴클레아제를 없이 섭씨 37도에서 30분 동안 인큐베이션한다. 다음으로, S1 버퍼를 흡인하고 PBS에 0.1%BSA를 첨가한다.
핵을 긁어 대략 주석이 달린 1.5 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 튜브를 항상 얼음 위에 보관하십시오. 핵을 섭씨 4도에서 5분 동안 약 4, 600배 G에서 원심분리한다.
펠렛을 마이크로리터 당 대략 1, 500 세포의 농도로 PBS에 재현탁시킨다. 튜브를 얼음 위에 놓고 즉시 프로토콜을 확산시켜 DNA 섬유 준비를 진행하십시오. 현미경 슬라이드에 탄소 연필로 주석을 달고 트레이에 평평하게 놓습니다.
튜브의 바닥을 탭하여 균질화를 보장하고 해당 슬라이드의 상단에 두 마이크로 리터의 셀을 추가하십시오. 용해 완충액의 여섯 마이크로 리터를 추가하고 약 다섯 번 위아래로 피펫팅하여 세포를 용해시킵니다. 피펫 팁을 사용하여 방울을 슬라이드의 바닥쪽으로 약간 당기고 실온에서 다섯 분 동안 배양하여 핵을 용해시킵니다.
슬라이드를 약 20도에서 40도 정도 기울이고 드롭이 일정한 저속으로 슬라이드 바닥으로 퍼지도록 합니다. 슬라이드를 어둠 속에서 실온에서 10 내지 15분 동안 건조시키십시오. 그런 다음, 갓 준비된 고정 용액이 들어있는 항아리에 담그고 실온에서 다섯 분 동안 인큐베이션하여 DNA를 슬라이드 상에 고정시킨다.
슬라이드를 PBS로 5분 동안 두 번 세척하고, 실온에서 40 내지 60분 동안 갓 제조된 2.5-몰 코리드르산으로 DNA를 변성시켰다. 슬라이드를 PBS로 5분 동안 세 번 세척하고 섭씨 37도에서 30-60분 동안 미리 예온한 5%BSA로 차단합니다. 용지를 부드럽게 탭하여 슬라이드에서 과도한 액체를 제거합니다.
슬라이드에 30 마이크로 리터의 일차 항체를 적하하고 덮개 슬립을 위에 놓습니다. 어둡고 습한 챔버에서 실온에서 1 내지 1.5시간 동안 인큐베이션한다. 슬라이드를 PBS가 있는 항아리에 한두 분 동안 넣은 다음 조심스럽게 덮개 슬립을 제거합니다.
항아리에 PBST로 다섯 분 동안 세 번 씻고 슬라이드를 PBS에 넣습니다. 종이를 부드럽게 두드려 과도한 액체를 제거하고 30 마이크로 리터의 보조 항체를 슬라이드에 적가하십시오. 덮개 슬립을 위에 놓습니다.
어둡고 습한 챔버에서 실온에서 45 내지 60분 동안 인큐베이션한다. 슬라이드를 세척하고 과량의 PBS를 한 번 더 제거하고 20 마이크로리터의 장착 시약을 슬라이드에 적하하는 단계를 반복합니다. 덮개 슬립을 위에 놓고 거품을 피하십시오.
침지 오일 한 방울을 세포가 용해 된 슬라이드 상단 근처에 놓습니다. 녹색 채널을 사용하여 배경의 녹색 점을 검색하여 초점을 찾습니다. 라이카 애플리케이션 스위트 소프트웨어를 열고 구입을 클릭한 다음 녹색 채널을 선택하십시오.
분석하기 전에 녹색 채널의 설정을 조정하십시오. 그런 다음 빨간색 채널로 변경하고 설정을 조정합니다. 섬유의 주요 농도를 찾아 가장자리로 이동하여 잘 퍼지고 겹치지 않는 개별 섬유를 찾으십시오.
하나의 채널만 사용하여 사진의 영역을 선택하고 잠재적 편향을 피하십시오. 오버레이 획득 아이콘을 클릭하고 올바른 현미경 배율을 위해 소프트웨어를 조정하십시오. 슬라이드당 약 15~20장의 사진을 녹색 채널에서 전체 슬라이드와 함께 찍은 다음 빨간색 채널에서 촬영합니다.
이제 두 채널이 병합되고 생성된 오버레이가 고유한 폴더로 이동됩니다. 빨간색과 녹색의 섬유를 볼 수 있습니다. ImageJ 소프트웨어를 열고 다섯 번째 아이콘을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하고 두 번째 옵션을 선택한 다음 세그먼트 선 도구를 선택하십시오.
왼쪽 버튼을 클릭하여 빨간색 또는 녹색 트랙의 정확한 경로를 그리고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 드로잉을 중지합니다. 키보드의 M 버튼을 눌러 길이를 측정합니다. S1 섬유의 경우 각 섬유에 대한 적색 및 녹색 트랙트 측정을 추적하고 다른 그림의 최소 150 개 섬유에서 적색 및 녹색 트랙트 길이를 측정합니다.
S1 섬유는 이러한 대표적인 이미지에 표시됩니다. 대조군-갭이 없는 초기 DNA 관과 S1 뉴클레아제에 의한 절단에 불침투성이 여기에 도시되어 있다. S1 뉴클레아제에 의해 절단된 갭에 대해 양성인 DNA 관은 더 짧은 CldU 관 길이를 초래하였다.
텍스트 원고에 광범위하게 설명된 차등 라벨링 체계는 갭 채우기 이벤트에 라벨링하기 위해 수행될 수 있다. 갭-필링 분석으로 명명된 이 분석에서, 적어도 하나의 CldU 패치 또는 더 적은 CldU 패치를 갖는 더 긴 IDU 트랙은 낮은 갭-채우기 밀도와 상응한다. 적어도 하나의 CldU 패치가 있는 더 짧은 IDU 트랙과 더 많은 CldU 패치가 있는 더 긴 IDU 트랙은 높은 갭 채우기 밀도와 일치합니다.
이 프로토콜의 투과화 단계는 S1 뉴클레아제가 손상된 DNA의 복제 동안 형성된 갭에 작용하는 데 매우 중요합니다. S1 뉴클레아제는 또한 혜성 분석 프로토콜에 사용되어 치료 후 지속되는 손상된 DNA의 복제 중에 형성된 갭을 검출 할 수 있습니다. S1 섬유 분석은 복제 후 갭이 암 취약성, 특히 BRCA1 및 2 유전자에 돌연변이를 옮기는 유방암 및 난소 암에서 암 취약성을 유발할 수 있다는 새로운 패러다임을위한 길을 열었습니다.
