يفتح بروتوكولنا إمكانيات جديدة للتحقيق في كيفية حدوث النسخ المتماثل على الحمض النووي التالف. يمكن للتقنيات الكشف عن تكوين وإصلاح فجوات الحمض النووي المفردة ، مقابل آفة الحمض النووي. يشق نوكلياز S1 الحمض النووي الأحادي الخيط ويسمح باكتشاف الفجوات اللاحقة للتكرار.
تم استخدام هذا النهج لأول مرة من قبل Dr.Meneghini و Dr.Cordiero-Stone في 1970s في البرازيل ، وتم تكييفه مؤخرا من قبلنا لفحص ألياف الحمض النووي. إن استخدام التقنية الموصوفة هنا لدراسة تكوين وإصلاح الفجوات اللاحقة للتكرار يمكن أن يوفر رؤى ثاقبة حول آلية إصلاح الحمض النووي واستجابة الإجهاد المتماثل التي تحافظ على سلامة الجينوم. بالنسبة لكلا البروتوكولين الموصوفين هنا ، ألياف S1 وفحوصات سد الفجوات ، من الأهمية بمكان تضمين جميع عناصر التحكم لضمان التفسير الدقيق للبيانات.
سيتم عرض الإجراء من قبل Davi J.Martins ، طالب الدكتوراه من مختبرنا ، والدكتورة Annabel Quinet ، وهي متعاونة طورت سابقا هذه التقنيات عند العمل في مجموعتنا. بادئ ذي بدء ، قم بشفط وسائط الثقافة وأضف على الفور وسائط الثقافة مع 20 ميكرومولار من وسائط IDU إلى الخلايا. احتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 20 دقيقة بالضبط.
ثم ، اغسل الخلايا بسرعة باستخدام PBS المسخن مسبقا مرتين وقم بتشعيعها ب 20 جول لكل متر مربع UV-C. استخدم الخلايا غير المعالجة كعناصر تحكم. أضف على الفور الوسائط التي تحتوي على 200 ميكرومولار CldU إلى الخلايا واحتضنها عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 60 دقيقة على وجه التحديد.
بعد ذلك ، اغسل الخلايا باستخدام PBS المسخن مسبقا مرتين وتغلغل فيها باستخدام المخزن المؤقت CSK 100 لمدة دقيقتين إلى 10 دقائق وفقا لخط الخلية في درجة حرارة الغرفة. بعد نفاذية CSK ، يمكن رؤية النوى التي لا تحتوي على أي سيتوبلازم تقريبا مقارنة بتلك التي كانت قبل النفاذية. صب PBS بعناية أسفل جانب كل بئر لغسل النوى مع PBS.
ثم اغسل النوى باستخدام المخزن المؤقت S1. احتضان النوى في المخزن المؤقت S1 مع 20 وحدة لكل ملليلتر S1 nuclease ، وبدون نوكليز S1 ، لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بشفط المخزن المؤقت S1 وأضف 0.1٪ BSA في PBS.
كشط النوى ونقلها إلى أنبوب مشروح تقريبا 1.5 ملليلتر. حافظ على الأنابيب على الجليد طوال الوقت. الطرد المركزي للنوى في حوالي 4،600 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.
أعد تعليق الكريات في PBS بتركيز حوالي 1،500 خلية لكل ميكرولتر. ضع الأنابيب على الجليد وانتقل على الفور إلى إعداد ألياف الحمض النووي عن طريق نشر البروتوكول. قم بتعليق شرائح المجهر بقلم رصاص كربوني وضعها مسطحة على صينية.
اضغط على الجزء السفلي من الأنبوب لضمان التجانس وإضافة ميكرولترين من الخلايا في الجزء العلوي من الشريحة المقابلة. أضف ستة ميكرولترات من مخزن التحلل العازل وقم بتحليل الخلايا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل حوالي خمس مرات. استخدم طرف الماصة لسحب القطرة قليلا نحو أسفل الشريحة واحتضانها لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لتحليل النوى.
قم بإمالة الشريحة عند حوالي 20 إلى 40 درجة واسمح للانخفاض بالانتشار إلى أسفل الشريحة بسرعة منخفضة ثابتة. اترك الشريحة لتجف في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 10 إلى 15 دقيقة. ثم اغمرها في جرة تحتوي على محلول التثبيت الطازج واحتضانها لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لتثبيت الحمض النووي على الشرائح.
اغسل الشرائح باستخدام PBS مرتين لمدة خمس دقائق وقم بتشويه الحمض النووي باستخدام حمض كلوريدريك 2.5 من الأضراس الطازج لمدة 40 إلى 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الشرائح باستخدام PBS ثلاث مرات لمدة خمس دقائق وقم بحظرها بنسبة 5٪ BSA التي تم تسخينها مسبقا لمدة 30 إلى 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية. اضغط برفق على الورق لإزالة السائل الزائد من الشرائح.
أضف 30 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية إلى الشرائح بقطرة وضع شريحة غطاء في الأعلى. احتضان لمدة 1 إلى 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة في غرفة مظلمة ورطبة. ضع الشرائح في وعاء مع PBS لمدة دقيقة إلى دقيقتين ثم قم بإزالة زلات الغطاء بعناية.
اغسل PBST في جرة ثلاث مرات لمدة خمس دقائق وضع الشرائح في PBS. قم بإزالة السائل الزائد عن طريق النقر بلطف على ورقة وإضافة 30 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية إلى الشرائح بقطرة. ضع شريحة غطاء في الأعلى.
احتضان لمدة 45 إلى 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غرفة مظلمة ورطبة. كرر خطوات غسل الشرائح وإزالة PBS الزائدة مرة أخرى وإضافة 20 ميكرولتر من كاشف التركيب إلى الشرائح. ضع غطاء في الأعلى وتجنب الفقاعات.
ضع قطرة من زيت الغمر بالقرب من الجزء العلوي من الشريحة حيث تم تحليل الخلايا. استخدم القناة الخضراء وابحث عن النقاط الخضراء في الخلفية للعثور على التركيز. افتح برنامج Leica Application Suite ، وانقر فوق اكتساب ، وحدد القناة الخضراء.
اضبط إعدادات القناة الخضراء قبل التحليل. بعد ذلك ، قم بالتغيير إلى القناة الحمراء واضبط الإعدادات. ابحث عن التركيز الرئيسي للألياف وانتقل إلى الحواف للعثور على الألياف الفردية المنتشرة جيدا وغير المتداخلة.
استخدم قناة واحدة فقط لتحديد المناطق للصور وتجنب التحيز المحتمل. انقر على أيقونة الحصول على تراكب واضبط البرنامج لتكبير المجهر الصحيح. التقط حوالي 15 إلى 20 صورة لكل شريحة إلى جانب الشريحة بأكملها في القناة الخضراء ثم في القناة الحمراء.
يتم الآن دمج القناتين ويتم نقل التراكب الذي تم إنشاؤه إلى مجلد فريد. من الممكن رؤية الألياف ذات الألوان الحمراء والخضراء. افتح برنامج ImageJ ، وانقر بزر الماوس الأيسر على الرمز الخامس ، وحدد الخيار الثاني ، ثم حدد أداة الخط المجزأ.
انقر بزر الماوس الأيسر لرسم المسار الدقيق للمسار الأحمر أو الأخضر وانقر بزر الماوس الأيمن لإيقاف الرسم. اضغط على الزر M على لوحة المفاتيح لقياس الطول. بالنسبة لألياف S1 ، تتبع قياسات المسالك الحمراء والخضراء لكل ألياف وقم بقياس أطوال المسالك الحمراء والخضراء من 150 ليفا على الأقل من صور مختلفة.
تظهر ألياف S1 في هذه الصور التمثيلية. يظهر هنا مسار الحمض النووي الناشئ المتحكم فيه بدون الفجوات والمنيع للانقسام بواسطة نوكليز S1. أدى مسار الحمض النووي الإيجابي للفجوات المشقوقة بواسطة نوكليز S1 إلى طول مسار CldU أقصر.
يمكن تنفيذ مخطط وضع العلامات التفاضلية الموصوف على نطاق واسع في مخطوطة النص لتسمية أحداث ملء الفجوات. في هذا الفحص ، المسمى فحص ملء الفجوات ، تتوافق مسارات IDU الأطول مع تصحيح CldU واحد على الأقل أو عدد أقل من بقع CldU مع كثافة منخفضة لملء الفجوة. وتتوافق مساحات IDU الأقصر ، مع رقعة CldU واحدة على الأقل ، ومساحات IDU الأطول مع المزيد من بقع CldU ، مع كثافة عالية لملء الفجوة.
تعد خطوة النفاذية لهذا البروتوكول أمرا بالغ الأهمية بالنسبة لنوكليز S1 للعمل على الفجوات التي تشكلت أثناء تكرار الحمض النووي التالف. يمكن أيضا استخدام نوكليز S1 في بروتوكول فحص المذنب للكشف عن الفجوات التي تشكلت أثناء تكرار الحمض النووي التالف الذي يستمر بعد العلاج. مهد فحص الألياف S1 الطريق للنموذج الجديد الذي يمكن أن تسبب الفجوات اللاحقة للتكرار قابلية الإصابة بالسرطان ، خاصة في سرطانات الثدي والمبيض التي تحمل طفرات في جينات BRCA1 و 2.
