Protokolümüz, hasarlı DNA'da replikasyonun nasıl gerçekleştiğini araştırmak için yeni olanaklar sunar. Teknikler, DNA lezyonunun karşısındaki tek sarmallı DNA boşluklarının oluşumunu ve onarımını tespit edebilir. S1 nükleaz, tek sarmallı DNA'yı parçalara ayırır ve replikatif sonrası boşlukların tespit edilmesini sağlar.
Bu yaklaşım ilk olarak 1970'lerde Brezilya'da Dr. Meneghini ve Dr. Cordiero-Stone tarafından kullanılmış ve yakın zamanda DNA lifi testine uyarlanmıştır. Post-replikatif boşlukların oluşumunu ve onarımını incelemek için burada açıklanan tekniği kullanmak, genom bütünlüğünü koruyan DNA onarımı ve replikasyon stres tepkisinin mekanizması hakkında fikir verebilir. Burada açıklanan her iki protokol için, S1 fiber ve boşluk doldurma tahlilleri, Verilerin doğru yorumlanmasını sağlamak için tüm kontrolleri dahil etmek çok önemlidir.
Prosedür, laboratuvarımızdan doktora öğrencisi olan Davi J.Martins ve grubumuzda çalışırken daha önce bu teknikleri geliştiren bir işbirlikçi olan Dr. Annabel Quinet tarafından gösterilecektir. Başlangıç olarak, kültür ortamını aspire edin ve hemen hücrelere 20 mikromolar IDU ortamı içeren kültür ortamını ekleyin. Hücreleri tam olarak 20 dakika boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.
Daha sonra, hücreleri önceden ısıtılmış PBS ile iki kez hızlı bir şekilde yıkayın ve metre kare UV-C başına 20 joule ışınlayın. Tedavi edilmemiş hücreleri denetim olarak kullanın. Hemen 200 mikromolar CldU içeren medyayı hücrelere ekleyin ve bunları tam olarak 60 dakika boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.
Bundan sonra, hücreleri önceden ısıtılmış PBS ile iki kez yıkayın ve oda sıcaklığındaki hücre hattına göre iki ila 10 dakika boyunca CSK 100 tamponu ile geçirgenleştirin. CSK geçirgenliğinden sonra, neredeyse hiç sitoplazması olmayan çekirdekler, geçirgenlikten öncekilere kıyasla görülebilir. Çekirdekleri PBS ile yıkamak için PBS'yi her bir kuyucuğun kenarından dikkatlice dökün.
Ardından, çekirdekleri S1 tamponu ile yıkayın. S1 tamponundaki çekirdekleri mililitre S1 nükleaz başına 20 ünite ile ve S1 nükleaz olmadan, 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, S1 arabelleğini aspire edin ve PBS'ye %0,1 BSA ekleyin.
Çekirdekleri kazıyın ve yaklaşık açıklamalı 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Tüpleri her zaman buz üzerinde tutun. Çekirdekleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca yaklaşık 4.600 kez G'de santrifüj yapın.
PBS'deki peletleri mikrolitre başına yaklaşık 1.500 hücre konsantrasyonunda yeniden askıya alın. Tüpleri buz üzerine yerleştirin ve hemen yayılma protokolü ile DNA lifi hazırlığına geçin. Mikroskop slaytlarına bir karbon kalemle açıklama ekleyin ve bunları bir tepsiye düz bir şekilde yerleştirin.
Homojenizasyonu sağlamak için tüpün altına dokunun ve ilgili kızağın üstüne iki mikrolitre hücre ekleyin. Lizis tamponunun altı mikrolitresini ekleyin ve hücreleri yaklaşık beş kez yukarı ve aşağı pipetleyerek lize edin. Pipet ucunu kullanarak damlayı sürgünün dibine doğru hafifçe çekin ve çekirdekleri lize etmek için oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın.
Slaytı yaklaşık 20 ila 40 derece eğin ve damlanın sabit bir düşük hızda slaytın dibine yayılmasına izin verin. Slaytın karanlıkta oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika kurumasını bekleyin. Ardından, taze hazırlanmış sabitleme çözeltisini içeren bir kavanoza batırın ve DNA'yı slaytlara sabitlemek için oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.
Slaytları beş dakika boyunca PBS ile iki kez yıkayın ve DNA'yı oda sıcaklığında 40 ila 60 dakika boyunca taze hazırlanmış 2.5 azı dişi kloridik asit ile denatüre edin. Slaytları beş dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın ve daha önce 37 santigrat derecede 30 ila 60 dakika ısıtılmış% 5 BSA ile bloke edin. Slaytlardaki fazla sıvıyı çıkarmak için kağıda hafifçe dokunun.
Slaytlara damla damla 30 mikrolitre birincil antikor ekleyin ve üstüne bir kapak kayması yerleştirin. Karanlık, nemli bir odada oda sıcaklığında 1 ila 1,5 saat kuluçkaya yatırın. Slaytları PBS'li bir kavanoza bir ila iki dakika boyunca yerleştirin ve ardından kapak fişlerini dikkatlice çıkarın.
PBST ile beş dakika boyunca üç kez bir kavanozda yıkayın ve slaytları PBS'ye yerleştirin. Bir kağıda hafifçe dokunarak fazla sıvıyı çıkarın ve slaytlara damla damla 30 mikrolitre ikincil antikor ekleyin. Üstüne bir kapak kayması yerleştirin.
Karanlık ve nemli bir odada oda sıcaklığında 45 ila 60 dakika kuluçkaya yatırın. Slaytları yıkamak ve fazla PBS'yi çıkarmak için adımları bir kez daha tekrarlayın ve kızaklara damla damla 20 mikrolitre montaj reaktifi ekleyin. Üstüne bir kapak kayması yerleştirin ve kabarcıklardan kaçının.
Hücrelerin lize edildiği slaytın üst kısmına bir damla daldırma yağı yerleştirin. Yeşil kanalı kullanın ve odağı bulmak için arka plandaki yeşil noktaları arayın. Leica Application Suite yazılımını açın, Al'a tıklayın ve yeşil kanalı seçin.
Analizden önce yeşil kanalın ayarlarını yapın. Ardından, kırmızı kanala geçin ve ayarları yapın. Ana lif konsantrasyonunu bulun ve iyi yayılmış, üst üste binmeyen, bireysel lifleri bulmak için kenarlara doğru hareket edin.
Resimlerin bölgelerini seçmek ve olası önyargılardan kaçınmak için yalnızca bir kanal kullanın. Bindirme Al simgesine tıklayın ve yazılımı doğru mikroskop büyütmesi için ayarlayın. Yeşil kanalda ve ardından kırmızı kanalda slaytın tamamının yanında slayt başına yaklaşık 15 ila 20 resim çekin.
İki kanal artık birleştirilir ve oluşturulan kaplama benzersiz bir klasöre taşınır. Lifleri kırmızı ve yeşil renklerle görmek mümkündür. ImageJ yazılımını açın, beşinci simgeye sol tıklayın, ikinci seçeneği seçin ve ardından Segmentlere Ayrılmış Çizgi aracını seçin.
Kırmızı veya yeşil yolun tam yolunu çizmek için sol tıklayın ve çizimi durdurmak için sağ tıklayın. Uzunluğu ölçmek için klavyedeki M düğmesine basın. S1 elyafı için, her bir elyaf için kırmızı ve yeşil yol ölçümlerini takip edin ve farklı resimlerden en az 150 fiberden kırmızı ve yeşil yol uzunluklarını ölçün.
Bu temsili görüntülerde bir S1 fiber gösterilmektedir. Kontrol-yeni ortaya çıkan DNA yolu boşluksuz ve S1 nükleaz tarafından bölünmeye karşı geçirimsiz burada gösterilmiştir. S1 nükleazı tarafından parçalanan boşluklar için pozitif DNA yolu, daha kısa bir CldU yolu uzunluğu ile sonuçlandı.
Metin makalesinde kapsamlı bir şekilde açıklanan diferansiyel etiketleme şeması, boşluk doldurma olaylarını etiketlemek için gerçekleştirilebilir. Boşluk doldurma testi olarak adlandırılan bu tahlilde, en az bir CldU yaması veya daha az CldU yaması içeren daha uzun IDU izleri, düşük boşluk doldurma yoğunluğuna karşılık gelir. En az bir CldU yaması ile daha kısa IDU yolları ve daha fazla CldU yaması olan daha uzun IDU yolları, yüksek boşluk doldurma yoğunluğuna karşılık gelir.
Bu protokolün geçirgenleştirme adımı, S1 nükleazın hasarlı DNA'nın replikasyonu sırasında oluşan boşluklar üzerinde hareket etmesi için çok önemlidir. S1 nükleazı, tedaviden sonra devam eden hasarlı DNA'nın replikasyonu sırasında oluşan boşlukları tespit etmek için kuyruklu yıldız testi protokolünde de kullanılabilir. S1 lif testi, replikatif sonrası boşlukların, özellikle BRCA1 ve 2 genlerinde mutasyon taşıyan meme ve yumurtalık kanserlerinde kanser kırılganlığına neden olabileceği yeni paradigmasının yolunu açtı.
