髌下脂肪垫衍生的间充质干细胞，或简称IFP-MSCs，是一种研究相对较少的干细胞类型。该协议是一种简单，可靠且可重复的方法，证明了IFP-MSCs从山羊窒息关节中的分离。该技术的主要优点是可以获得大量高质量的IFP-MSC。
分离的IFP-MSCs可以分化为多个谱系并具有广泛的再生潜力。由于其解剖位置，IFP-MSCs在修复软骨缺陷和缓解骨关节炎软骨退化方面引起了人们的兴趣。该方法对组织工程和再生医学领域中基于细胞的治疗具有意义。
IFP-MSC的分离，扩增和分化程序将由Sugata Hazra博士和Aman Mahajan先生演示。要开始分离髌下脂肪垫间充质干细胞或IFP-MSCs，请在灭菌的收集样品盒中收集包含后肢股骨和胫骨区域约15厘米的山羊股骨关节。将样品储存在四摄氏度，以便运输到实验室进行进一步处理。
将样品放在150毫米培养皿上，并确保在整个过程中无菌处理样品和生物安全柜。用补充有抗生素的高压灭菌PBS彻底冲洗。使用PBS保持样品水合。
仔细检查样本的解剖区域。为了便于取用，用一只手握住股骨的端面，然后用锋利的剪刀将其纵向切向关节，从而完全去除两块长骨上多余的组织。然后，在不干扰关节囊周围组织的情况下，从骨骼中去除肌肉和脂肪组织。
同样，在样本的胫骨端做另一个切口，并从胫骨中去除肌肉和脂肪组织。确保两块长骨完全暴露，并且关节囊可见。接下来，从滑膜的任一侧切开一个切口，切开关节。
使用新鲜消毒的剪刀和镊子从滑膜和髌韧带上切开髌骨。立即将分离的髌骨放入含有PBS的培养皿中。从分离的髌骨中，用剪刀和镊子去除内表面上存在的整个脂肪垫。
将其收集在另一个新鲜的培养皿中，然后用手术刀切碎。包括其他手术工具，以获得大约两到三毫米的小脂肪段。使用刮刀将切碎的组织转移到50毫升离心管中，并使用试管混合器在室温下用补充有抗生素的PBS洗涤三次15分钟。
对于酶消化，在Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM）中孵育约5克碎的组织，低葡萄糖培养基含有每毫升1.5毫克II型胶原酶和2%FBS，在37摄氏度下孵育12至16小时。小心地吸出消化的组织并通过70微米的细胞过滤器过滤，以去除任何未消化的部分。将滤液在15毫升离心管中以150倍克离心五分钟。
在用DMEM低葡萄糖洗涤细胞沉淀两次之前，除去上清液。将沉淀重新悬浮在完整的DMEM（也称为膨胀培养基）中。将细胞接种在 150 毫米培养皿上，并在补充有每毫升 5 纳克碱性成纤维细胞生长因子 （BFGF） 和每毫升 50 微克 2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐的扩增培养基中培养。
将细胞在 37 摄氏度下在 5% 二氧化碳培养箱中孵育，以使细胞粘附和增殖。每天监测细胞的附着和生长。为了正确维护和扩展 IFP-MSC，请每三天更换一次介质。
更换培养基时，将新鲜的每毫升 5 纳克 BFGF 和每毫米 50 微克的 2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐直接添加到培养皿中。一旦细胞汇合80%至90%，通过从培养皿中取出扩增培养基并用1X PBS洗涤细胞来传代培养它们。然后在培养皿中加入四毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA，并将细胞在37摄氏度下在5%二氧化碳培养箱中孵育。
四分钟后，轻拍平板侧面以移开细胞。在显微镜下确认所有细胞完全脱离。一旦确认，加入等体积的扩增培养基以中和胰蛋白酶。
使用移液管将这些解离的细胞收集在新鲜的15毫升聚丙烯管中，并在室温下以150倍g离心5分钟。弃去上清液并将沉淀重悬于所需体积的膨胀培养基中。使用标准细胞计数方法计数细胞，并在150毫升培养皿中以每平方厘米10， 000个细胞的接种密度传代培养它们以进一步扩增。
对于所有测定，使用传代号为 P2 至 P5 的融合单层细胞。当扩增的细胞达到80%至90%汇合度时，使用胰蛋白酶-EDTA溶液解离细胞，然后将其沉淀在150倍克的15毫升离心管中五分钟。然后将沉淀重悬于山羊血浆中，密度为每50微升200万个细胞。将50微升含有细胞的血浆加入灭菌的90毫米培养皿中，然后加入终浓度为0.3%的氯化钙充分混合以制造交联血浆水凝胶。
将制备的水凝胶在37摄氏度下孵育40分钟后，将水凝胶转移到含有成软骨培养基的24孔组织培养板中。每三天更换一次介质，持续 14 天。在没有TGF-β1的完整DMEM培养基中培养的水凝胶被认为是非诱导对照。
在血浆水凝胶中细胞的软骨分化14天后，用PBS洗涤水凝胶三次，每次五分钟，并将样品固定在中性缓冲福尔马林中三小时。分离的IFP-MSCs具有均匀的贴壁性，并在体外培养后24小时内获得细长的形态。这些细胞在扩增后六天内有效增殖了80%至90%的汇合度，并显示出克隆生成能力，表明有效的增殖和自我更新能力。
当处理分化为成脂肪谱系时，分离的细胞产生脂滴，在第14天和第21天通过油红O染色证实。这种油滴在没有脂肪诱导因子的细胞中是不可见的。包封在血浆水凝胶中的分离细胞在诱导组14天后显示出白色和有光泽的新组织的形成，显示出软骨生成潜力。
未诱导组组织呈淡白色，光泽度降低。此外，诱导组中Alcian Blue和Safranin O的组织学染色阳性表明，细胞可以分泌硫酸化糖胺聚糖，这是软骨基质的主要成分之一。相比之下，来自未诱导组的水凝胶切片对Safranin O和Alcian Blue染色呈阴性，仅在存在软骨刺激的情况下证实了间充质干细胞的软骨分化潜力。
用成骨培养基诱导的分离细胞显示出碱性磷酸酶的阳性染色，在14天结束时证实了矿化。成骨诱导28天后，用茜素红S染色观察钙化沉积。结果强调了诱导细胞分化为脂肪、软骨和成骨谱系的潜力。
必须在无菌条件下处理样品以避免污染。确定髌骨的正确位置也很重要。该程序为从滑膜和滑液中分离各种细胞类型（例如关节软骨细胞，韧带成纤维细胞和干细胞）开辟了途径，在再生医学中具有广泛的应用。
使用该技术分离IFP-MSCs后，特别研究了其使用支架和无支架方法再生肌肉骨骼组织（如软骨，骨骼和韧带）的有效性。
