الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الدهون تحت الرضفة ، أو باختصار ، IFP-MSCs ، هي نوع من الخلايا الجذعية الأقل دراسة نسبيا. هذا البروتوكول هو طريقة بسيطة وموثوقة وقابلة للتكرار توضح عزل IFP-MSCs عن مفصل خنق الماعز. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن الحصول على عدد كبير من IFP-MSCs عالية الجودة.
يمكن أن تتمايز IFP-MSCs المعزولة إلى سلالات متعددة وتمتلك إمكانات تجديد واسعة النطاق. نظرا لموقعها التشريحي ، اكتسبت IFP-MSCs اهتماما بإصلاح عيوب الغضروف والتخفيف من تدهور الغضروف في هشاشة العظام. هذه الطريقة لها آثار على العلاج القائم على الخلايا في مجال هندسة الأنسجة والطب التجديدي.
سيتم توضيح إجراءات عزل وتوسيع وتمايز IFP-MSCs من قبل الدكتور سوغاتا هازرا والسيد أمان ماهاجان. لبدء عزل الخلايا الجذعية الوسيطة تحت الرضفة الدهنية ، أو IFP-MSCs ، اجمع المفاصل الفخذية الظنبوبية الماعز التي تضم حوالي 15 سم من مناطق الفخذ والظنبوب للأطراف الخلفية في صندوق عينة تجميع معقمة. قم بتخزين العينة عند أربع درجات مئوية لنقلها إلى المختبر لمزيد من المعالجة.
ضع العينة على طبق بتري 150 ملم وتأكد من معالجة العينة بشكل معقم وخزانة السلامة الحيوية طوال الإجراء. شطفه جيدا مع PBS المعقم تستكمل بالمضادات الحيوية. حافظ على رطوبة العينة باستخدام برنامج تلفزيوني.
فحص بعناية المناطق التشريحية للعينة. لسهولة الوصول ، قم بإزالة الأنسجة الزائدة من كل من العظام الطويلة تماما عن طريق إمساك السطح النهائي لعظم الفخذ بيد واحدة وقطعه طوليا نحو المفصل باستخدام مقص حاد. ثم ، دون إزعاج الأنسجة المحيطة بكبسولة المفصل ، قم بإزالة العضلات والأنسجة الدهنية من العظام.
وبالمثل ، قم بعمل شق آخر في نهاية الظنبوب للعينة وإزالة العضلات والأنسجة الدهنية من عظم الظنبوب. تأكد من أن كلا العظمين الطويلين مكشوفان تماما وأن كبسولة المفصل مرئية. بعد ذلك ، قم بعمل شق من جانبي الغشاء الزليلي لفتح المفصل المفصلي.
قطع الرضفة الحرة من الغشاء الزليلي والأربطة الرضفية باستخدام مقص وملقط معقم جديد. ضع الرضفة المنفصلة على الفور في طبق بتري يحتوي على برنامج تلفزيوني. من الرضفة المنفصلة ، قم بإزالة وسادة الدهون بالكامل الموجودة على السطح الداخلي باستخدام المقص والملقط.
اجمعها في طبق بتري طازج آخر ، وفرمها باستخدام مشرط. قم بتضمين أدوات جراحية أخرى للحصول على شرائح الدهون الصغيرة التي تبلغ حوالي 2 إلى 3 ملليمترات. استخدم ملعقة لنقل المنديل المفروم إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر واغسله ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني مكمل بالمضادات الحيوية لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة باستخدام خلاط أنبوب اختبار.
للهضم الأنزيمي ، احتضن حوالي خمسة جرامات من الأنسجة المفرومة في وسائط النسر المعدلة من Dulbecco ، أو DMEM ، وهي وسائط منخفضة الجلوكوز تحتوي على 1.5 ملليغرام لكل ملليلتر من النوع الثاني كولاجيناز و 2٪ FBS عند 37 درجة مئوية لمدة 12 إلى 16 ساعة. قم بشفط الأنسجة المهضومة بعناية وقم بترشيحها من خلال مصفاة خلايا 70 ميكرون لإزالة أي جزء غير مهضوم. جهاز طرد مركزي للمرشح في أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر بمعدل 150 مرة جم لمدة خمس دقائق.
قم بإزالة المادة الطافية قبل غسل حبيبات الخلية بجلوكوز منخفض DMEM مرتين. أعد تعليق الحبيبات بالكامل DMEM ، والمعروفة أيضا باسم وسائط التوسع. بذر الخلايا على طبق بتري 150 ملم واستزرعها في وسائط التمدد المكملة بخمسة نانوجرام لكل ملليلتر من عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي ، أو BFGF ، و 50 ميكروغرام لكل ملليلتر 2-فوسفو-L-حمض الأسكوربيك ملح ثلاثي الصوديوم.
احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون للسماح للخلايا بالالتصاق والتكاثر. مراقبة ارتباط ونمو الخلايا يوميا. للصيانة المناسبة وتوسيع IFP-MSCs ، قم بتغيير الوسائط كل ثلاثة أيام.
أثناء تغيير الوسائط ، أضف خمسة نانوجرام جديدة لكل ملليلتر BFGF و 50 ميكروغرام لكل ملليمتر من ملح الصوديوم ثلاثي الصوديوم 2-Phospho-L-ascorbic مباشرة إلى طبق بتري. بمجرد أن تصبح الخلايا متقاربة بنسبة 80٪ إلى 90٪ ، قم بزراعتها الفرعية عن طريق إزالة وسائط التمدد من طبق بتري وغسل الخلايا باستخدام 1X PBS. ثم أضف أربعة ملليلتر من 0.25٪ Trypsin-EDTA إلى الطبق واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
بعد أربع دقائق ، اضغط على اللوحة الموجودة على جانبها لإزاحة الخلايا. تأكيد الانفصال الكامل لجميع الخلايا تحت المجهر. بمجرد التأكيد ، أضف حجما متساويا من وسائط التمدد لتحييد التربسين.
استخدم ماصة لجمع هذه الخلايا المنفصلة في أنبوب بولي بروبيلين جديد سعة 15 ملليلتر وقم بطردها بالطرد المركزي بمعدل 150 مرة جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في الحجم المطلوب من وسائط التمدد. عد الخلايا باستخدام طريقة عد الخلايا القياسية واستزرعها لمزيد من التوسع بكثافة بذر تبلغ 10،000 خلية لكل سنتيمتر مربع في طبق بتري سعة 150 ملليلتر.
لجميع المقايسات ، استخدم طبقة أحادية متقاربة من الخلايا من رقم المرور P2 إلى P5. عندما تصل الخلايا الموسعة إلى 80٪ إلى 90٪ ، قم بفصل الخلايا باستخدام محلول Trypsin-EDTA قبل تكويرها في أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر بمعدل 150 مرة جم لمدة خمس دقائق. ثم أعد تعليق الحبيبات في بلازما الماعز بكثافة 2 مليون خلية لكل 50 ميكرولتر. أضف 50 ميكرولتر من البلازما التي تحتوي على الخلايا على طبق بتري معقم 90 ملم ، متبوعا بإضافة كلوريد الكالسيوم بتركيز نهائي قدره 0.3٪ امزج جيدا لتصنيع هيدروجيل البلازما المتصالب.
بعد احتضان الهيدروجيل المصنع عند 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة ، انقل الهلاميات المائية إلى ألواح زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا والتي تحتوي على وسائط غضروفية. قم بتغيير الوسائط كل ثلاثة أيام لمدة 14 يوما. تعتبر الهلاميات المائية المستزرعة في وسائط DMEM كاملة بدون TGF-beta 1 عناصر تحكم غير مستحثة.
بعد 14 يوما من التمايز الغضروفي للخلايا في هيدروجيل البلازما ، اغسل الهلاميات المائية ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة خمس دقائق لكل منها ، وقم بإصلاح العينات في فورمالين محايد لمدة ثلاث ساعات. كانت IFP-MSCs المعزولة ملتصقة بشكل متجانس وحققت مورفولوجيا ممدودة في غضون 24 ساعة من الزراعة في المختبر. تكاثرت الخلايا بكفاءة 80٪ إلى 90٪ التقاء في غضون ستة أيام من التوسع وأظهرت قدرة استنساخ ، مما يشير إلى قدرات تكاثرية وتجديد ذاتي فعالة.
عند معالجتها للتمايز إلى سلالة أديبوجينية ، أنتجت الخلايا المعزولة قطرات دهنية ، وهو ما أكده تلطيخ الزيت الأحمر O في اليومين 14 و 21. لم تكن قطرات الزيت هذه مرئية في الخلايا بدون عوامل محفزة للأديبوجين. أظهرت الخلايا المعزولة المغلفة في هيدروجيل البلازما تكوين أنسجة جديدة بيضاء ولامعة بعد 14 يوما في المجموعة المستحثة أظهرت إمكانات الغضروف.
كان لدى المجموعة غير المستحثة أنسجة بيضاء شاحبة مع انخفاض اللمعان. بالإضافة إلى ذلك ، أشار التلوين النسيجي الإيجابي ل Alcian Blue و Safranin O في المجموعة المستحثة إلى أن الخلايا يمكن أن تفرز الجليكوزامينوجليكان الكبريتي ، وهو أحد المكونات الرئيسية لمصفوفة الغضروف. في المقابل ، كانت مقاطع الهيدروجيل من المجموعات غير المستحثة سلبية لتلطيخ Safranin O و Alcian Blue ، مما يؤكد إمكانية التمايز الغضروفي للخلايا الجذعية الوسيطة فقط في وجود محفزات غضروفية.
أظهرت الخلايا المعزولة المستحثة بوسائط عظمية تلطيخ إيجابي للفوسفاتيز القلوي ، مما يؤكد التمعدن في نهاية 14 يوما. بعد 28 يوما من الحث العظمي ، لوحظت الترسبات المتكلسة مع تلطيخ Alizarin Red S. أكدت النتائج على إمكانات التمايز للخلايا المستحثة إلى سلالات دهنية وغضروفية وعظمية.
من الضروري معالجة العينة في ظل ظروف معقمة لتجنب التلوث. من المهم أيضا تحديد الموقع الصحيح للرضفة. يفتح هذا الإجراء الطريق لعزل أنواع مختلفة من الخلايا ، مثل الخلايا الغضروفية المفصلية ، والخلايا الليفية الأربطة ، والخلايا الجذعية من الغشاء الزليلي والسائل الزليلي ، والتي لها تطبيقات واسعة في الطب التجديدي.
بعد عزل IFP-MSCs باستخدام هذه التقنية ، تم التحقيق في فعاليتها بشكل خاص لتجديد الأنسجة العضلية الهيكلية ، مثل الغضاريف والعظام والأربطة باستخدام أساليب خالية من السقالات والسقالات.
