슬개골 하부 지방 패드 유래 중간엽 줄기 세포 또는 간단히 IFP-MSC는 상대적으로 덜 연구된 줄기 세포 유형입니다. 이 프로토콜은 염소 스티플 조인트에서 IFP-MSC의 분리를 입증하는 간단하고 신뢰할 수 있으며 재현 가능한 방법입니다. 이 기술의 주요 장점은 많은 수의 고품질 IFP-MSC를 얻을 수 있다는 것입니다.
분리된 IFP-MSC는 여러 계통으로 분화할 수 있으며 광범위한 재생 잠재력을 가지고 있습니다. 해부학 적 위치로 인해 IFP-MSC는 연골 결함을 복구하고 골관절염의 연골 분해를 완화하는 데 관심을 갖게되었습니다. 이 방법은 조직 공학 및 재생 의학 분야의 세포 기반 치료에 영향을 미칩니다.
IFP-MSC의 분리, 확장 및 분화 절차는 Sugata Hazra 박사와 Aman Mahajan에 의해 시연 될 것입니다. 슬개골 하부 지방 패드 중간엽 줄기 세포(IFP-MSC)의 분리를 시작하려면 멸균된 수집 샘플 상자에서 뒷다리의 대퇴골 및 경골 부위의 약 15cm를 포함하는 염소 대퇴골 관절을 수집합니다. 추가 처리를 위해 실험실로 운반하기 위해 샘플을 섭씨 4도에 보관하십시오.
샘플을 150mm 페트리 접시에 놓고 절차 전반에 걸쳐 샘플을 무균 상태로 처리하고 생물 안전 캐비닛을 처리해야 합니다. 항생제가 보충 된 오토 클레이브 PBS로 철저히 헹굽니다. PBS를 사용하여 샘플을 수화시킵니다.
샘플의 해부학 적 영역을주의 깊게 검사하십시오. 쉽게 접근 할 수 있도록 한 손으로 대퇴골의 끝면을 잡고 날카로운 가위를 사용하여 관절쪽으로 세로로 절단하여 긴 뼈에서 여분의 조직을 완전히 제거합니다. 그런 다음 관절낭을 둘러싼 조직을 방해하지 않고 뼈에서 근육과 지방 조직을 제거하십시오.
유사하게, 샘플의 경골 끝에서 다른 절개를하고 경골 뼈에서 근육과 지방 조직을 제거하십시오. 긴 뼈가 완전히 노출되고 관절낭이 보이는지 확인하십시오. 다음으로, 활막의 양쪽에서 절개하여 관절 관절을 잘라냅니다.
신선한 멸균 된 가위와 집게를 사용하여 활막과 슬개골 인대에서 슬개골을 잘라냅니다. 분리 된 슬개골을 PBS가 들어있는 페트리 접시에 즉시 넣으십시오. 분리 된 슬개골에서 가위와 집게를 사용하여 내부 표면에있는 전체 지방 패드를 제거하십시오.
다른 신선한 페트리 접시에 모으고 메스를 사용하여 말하십시오. 약 2-3 밀리미터의 작은 지방 부분을 얻기 위해 다른 수술 도구를 포함하십시오. 주걱을 사용하여 다진 조직을 50 밀리리터 원심 분리 튜브로 옮기고 시험관 믹서를 사용하여 실온에서 15 분 동안 항생제가 보충 된 PBS로 세 번 씻습니다.
효소 소화를 위해 Dulbecco의 변형 된 독수리 배지 (DMEM), 유형 II 콜라게나제 1.5 밀리그램 및 섭씨 37도에서 2 % FBS를 포함하는 저혈당 배지에서 다진 조직 약 5g을 섭씨 37도에서 12-16 시간 동안 배양하십시오. 소화된 조직을 조심스럽게 흡인하고 70미크론 세포 여과기로 여과하여 소화되지 않은 부분을 제거합니다. 여과액을 150 회 g의 150 밀리리터 원심 분리 튜브에서 5 분 동안 원심 분리합니다.
세포 펠렛을 DMEM 저혈당으로 2회 세척하기 전에 상청액을 제거한다. 확장 매체라고도 하는 완전한 DMEM에 펠릿을 다시 현탁합니다. 세포를 150mm 페트리 접시에 놓고 기본 섬유 아세포 성장 인자 (BFGF) 밀리리터 당 5 나노 그램과 밀리리터 당 50 마이크로 그램 2- 포스 포 -L- 아스코르브 산 삼 나트륨 염이 보충 된 확장 배지에서 배양합니다.
세포가 부착되고 증식할 수 있도록 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도의 세포를 배양합니다. 매일 세포의 부착과 성장을 모니터링하십시오. IFP-MSC의 적절한 유지 관리 및 확장을 위해 3일마다 미디어를 교체하십시오.
배지를 교체하는 동안 BFGF 밀리리터당 신선한 5나노그램과 밀리미터당 50마이크로그램의 2-Phospho-L-아스코르브산 삼나트륨 염을 페트리 접시에 직접 추가합니다. 세포가 80%에서 90% 합류하면 페트리 접시에서 확장 배지를 제거하고 1X PBS로 세포를 세척하여 계대 배양합니다. 그런 다음 접시에 0.25 % 트립신 -EDTA 4 밀리리터를 넣고 5 % 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다.
4분 후 플레이트를 옆으로 두드려 세포를 제거합니다. 현미경으로 모든 세포의 완전한 분리를 확인하십시오. 확인되면 동일한 양의 확장 배지를 추가하여 트립신을 중화합니다.
피펫을 사용하여 해리 된 세포를 새로운 15 밀리리터 폴리 프로필렌 튜브에 모으고 실온에서 5 분 동안 150 회 g으로 원심 분리합니다. 상청액을 버리고 원하는 부피의 팽창 배지에 펠릿을 재현탁합니다. 표준 세포 계수 방법을 사용하여 세포를 계수하고 150 밀리리터 페트리 접시에서 평방 센티미터 당 10, 000 세포의 파종 밀도로 추가 확장을 위해 계대 배양하십시오.
모든 분석에 대해, 계대 번호 P2 내지 P5의 세포의 합류 단층을 사용한다. 확장된 세포가 80%에서 90% 컨플루언시에 도달하면 트립신-EDTA 용액을 사용하여 세포를 해리한 후 150회 g의 15밀리리터 원심분리 튜브에서 5분 동안 펠릿화합니다. 그런 다음 펠릿을 염소 혈장에 50 마이크로 리터 당 2 백만 세포의 밀도로 재현 탁시킵니다. 멸균 된 90mm 페트리 접시에 세포를 포함하는 50 마이크로 리터의 혈장을 첨가 한 다음 최종 농도 0.3 %의 염화칼슘을 첨가하여 잘 섞어 가교 혈장 하이드로 겔을 제조합니다.
제작된 하이드로겔을 섭씨 37도에서 40분 동안 배양한 후, 하이드로겔을 연골성 배지가 포함된 24웰 조직 배양 플레이트로 옮깁니다. 14일 동안 3일마다 미디어를 교체합니다. TGF-베타 1이 없는 완전한 DMEM 배지에서 배양된 하이드로겔은 유도되지 않은 대조군으로 간주됩니다.
혈장 하이드로겔에서 세포의 연골생성 분화 14일 후, 하이드로겔을 PBS로 각각 5분 동안 3회 세척하고, 시료를 중성 완충 포르말린에 3시간 동안 고정하였다. 분리된 IFP-MSC는 균질적으로 부착되었고, 시험관내 배양 후 24시간 이내에 길쭉한 형태를 얻었다. 세포는 확장 후 6일 이내에 80%에서 90%의 컨플루언시를 효율적으로 증식하고 클론 생성 능력을 나타내어 효율적인 증식 및 자가 재생 능력을 나타냅니다.
지방원성 계통으로 분화하도록 처리하였을 때, 분리된 세포는 지질 방울을 생성하였고, 이는 14일 및 21일에 Oil Red O 염색에 의해 확인되었다. 이러한 오일 방울은 지방생성 유도 인자 없이 세포에서 보이지 않았다. 분리된 세포는 혈장 하이드로젤에 캡슐화되어 연골형성 가능성을 보인 유도군에서 14일 후에 백색 및 광택 신조직의 형성을 보였다.
유도되지 않은 그룹은 광택이 감소된 창백한 흰색 조직을 가졌습니다. 또한, 유도 된 그룹에서 Alcian Blue 및 Safranin O에 대한 양성 조직 학적 염색은 세포가 연골 기질의 주요 구성 요소 중 하나 인 황산화 글리코 사 미노 글리 칸을 분비 할 수 있음을 나타냅니다. 대조적으로, 유도되지 않은 그룹의 하이드로 겔 섹션은 Safranin O 및 Alcian Blue 염색에 대해 음성이었으며, 연골 성 자극이있는 경우에만 중간 엽 줄기 세포의 연골 분화 가능성을 확인했다.
골형성 배지로 유도된 분리된 세포는 알칼리성 포스파타제에 대해 양성 염색을 나타내어 14일 말에 광물화를 확인했습니다. 골형성 유도 28일 후, 석회화된 침착을 알리자린 레드 S 염색으로 관찰하였다. 결과는 유도 된 세포의 지방 형성, 연골 형성 및 골 형성 계통으로의 분화 가능성을 강조했습니다.
오염을 피하기 위해 무균 조건에서 샘플을 처리하는 것이 필수적입니다. 슬개골의 정확한 위치를 식별하는 것도 중요합니다. 이 절차는 관절 연골 세포, 인대 섬유 아세포, 활액 및 활액에서 줄기 세포와 같은 다양한 세포 유형을 분리 할 수있는 길을 열어 재생 의학에 광범위하게 적용됩니다.
이 기술을 사용하여 IFP-MSC를 분리 한 후, 스캐 폴드 및 스캐 폴드가없는 접근법을 사용하여 연골, 뼈 및 인대와 같은 근골격계 조직의 재생에 대한 효과를 특히 조사했습니다.
