用于组织学成像的高速紫外光声显微镜，通过深度学习辅助虚拟染色

术中手术监护仪分析仍然是肿瘤切除手术中的一大挑战，因为它需要一种诊断工具来准确，快速地确认复杂的癌组织切除。然后可以避免由于阳性手术边缘而重复手术。我们的高速开顶紫外光声显微镜可以在18分钟内提供组织样品的标记组织学图像，成像面积为5×5毫米平方，显示出巨大的术中手术边缘分析潜力。

演示该程序的将是来自我实验室的最后一年博士生的Xiufeng Li。首先，使用波长为266纳米的Q开关二极管泵浦固态激光器作为激励源，为微观系统设置光学照明。安装两个凸透镜以扩展激光束，并在靠近第一个凸透镜的焦点附近放置一个针孔以进行空间滤波。

使用一维振镜向上反射激光束。在物镜的帮助下，将激光束聚焦在样品上。将环形聚焦UT固定，有效区域朝上，放入实验室制作的水箱中，水箱底部有一个光学透明窗口，由薄石英盖玻片覆盖，然后将水箱连接到显微镜的两轴手动载物台上，以控制UT的横向位置。完成后，打开紫外激光器并调整UT的位置，以允许激光束通过UT的中心，然后关闭紫外激光器并用去离子水填充水箱以完全浸入UT。将UT的输出连接到两个放大器以获得56分贝的总增益，然后将第二个放大器的输出连接到安装在计算机中的数据采集卡或DAQ。

接下来，将样品架连接到连接到xy电动载物台的z轴手动载物台上，然后在样品架的空孔周围放置四块双面胶带。然后，通过将黑色胶带连接到载玻片上，然后将载玻片放置以覆盖样品架的孔，黑色胶带朝下，继续对齐系统。将载玻片压在样品架上后，放下样品架以将载玻片浸入水中。

断开环形UT和放大器，然后将UT连接到脉冲发生器/接收器，并将脉冲发生器/接收器的输出连接到示波器。将脉冲发生器/接收器操作到脉冲回波模式，脉冲幅度为6，增益为20分贝。设置参数后，调整样品架的z位置，定义超声波信号最大的声学焦平面的位置。

在将增益设置为60分贝之前，将脉冲/接收器更改为传输模式，然后启用激光输出并调整物镜的z位置，以最大化示波器测量的光声或PA信号。为了使生成的PA信号对称且最大，请调整环形UT的横向位置，然后调整样品架的z位置以最大化PA信号。重复对物镜和样品支架的z位置进行调整，以优化PA信号的对称性和幅度。

优化 PA 信号后，在示波器上记录 PA 波到达 UT 所需的时间延迟或时间。移动样品架以成像黑色胶带的不同位置。调整样品架的平整度，使从黑色胶带的每个位置生成的PA信号具有与先前测量的信号相同的时间延迟。

系统对准完成后，关闭激光器并将UT连接到两个放大器。为了制备福尔马林固定和石蜡包埋的小鼠脑切片，将收获的大脑固定在10%中性缓冲福尔马林中。24小时后，用分级酒精脱水，用二甲苯清除并用石蜡包埋，处理固定的大脑。

使用切片机获得五微米厚的嵌入式大脑切片。将样品片放在石英载玻片上，在60摄氏度的烤箱中干燥一小时。之后，用清除剂对大脑切片进行脱蜡，以避免石蜡的高背景信号。

为了制备新鲜的小鼠脑切片，用PBS清洗收获的小鼠大脑，然后用手切一片五毫米厚的脑样品，然后用PBS清洗脑切片以除去横截面上的血液。对于样品放置，准备一个实验室制作的样品罐，带有厚度为10微米的UV透明聚乙烯膜，然后在膜上加入一滴水，并将生物样品放在样品罐上以覆盖水。接下来，将含样品罐放在样品架上，确保覆盖样品架的空孔。

将紫外激光设置为外部触发模式，并使用实验室构建的实验室视图程序设置手稿中描述的扫描参数。通过设置x轴和y轴电机的移动步长数，在小区域上开始试验扫描，然后调整z轴手动载物台以将样品放置在焦平面上以获得最大的PA信号。将x轴和y轴电机移动到所需的起点并通过设置xn和yn值设置扫描区域后，启动图像采集程序。

当需要图像时，关闭激光器并取下样品架。将新鲜的生物组织储存在10%中性缓冲福尔马林中。借助实验室构建的图像处理算法，使用收集的PA信号重建最大振幅投影图像。

代表性分析显示了FFPE小鼠脑切片的UV-PAM和H&E图像。在放大的UV-PAM图像中，可以解析单个细胞核。在标准的H&E染色图像中发现了相应的细胞核，显示了当前用于细胞成像系统的高精度。

应用深度学习算法将灰度UV-PAM图像传输到虚拟H&E染色图像。重要的是要调整环形超声波换能器的位置，以允许紫外光在系统对准期间穿过中心。这确保了在激光器开启时可以获得可检测的光声信号并进一步优化。

我们的分类算法可以进一步整合，对图像中的肿瘤和正常区域进行分类，作为医疗专业人员的辅助成像和诊断平台。