这种方法将使研究人员能够探测难以研究的系统，如肽和第一排过渡金属离子，这两者都在使用更标准的应用时通常具有挑战性。这里的主要优点是使用正交技术，因为它们可以很好地互补，这可以更深入地了解系统并帮助我们不错过任何现象。本视频中详细介绍的方法非常适合研究其他系统。
虽然我们用Cu（II）和肽来展示它，但它可用于许多不同的金属肽和金属蛋白相互作用。我认为最困难的部分是为您的金属离子和肽找到一个好的缓冲选择。我会查阅文献，看看其他人以前使用过哪些缓冲区。
演示该程序的将是我研究实验室的研究生Sohee Choi。首先，打开电子吸收分光光度计，在使用前让它预热约 15 到 20 分钟。然后启动分光光度计软件并配置参数，例如扫描范围为200至900纳米，扫描范围为每秒200纳米，双光束基线校正。
接下来，收集光束路径中没有比色皿或样品的基线。在双光束分光光度计中使用两个匹配的比色皿，将一个比色皿装入 115 微纯水，另一个比色皿装入 115 微升肽样品，同时确保比色皿中没有气泡，因为这些气泡会干扰信号。之后，将装有超纯水的比色皿放入参考光束中，将含有肽的比色皿放入样品束中。
然后收集无金属肽的吸收光谱。将亚化学计量量的Cu（II）溶液与肽样品一起添加到比色皿中，并记录体积以供以后分析。轻轻地上下管道以混合溶液，同时避免产生气泡。
平衡五分钟后，将比色皿放回样品池支架中并记录吸收光谱。然后重复将Cu（II）等分试样添加到肽溶液中以获取各种等效物，并记录添加到比色皿中的Cu（II）的总体积。如前所述，在两个匹配的比色皿中初始化软件后，将一个比色皿装入115微升超纯水，另一个比色皿装入115微升铜芬复合溶液。
将装有水的比色皿放入参考光束中，将带有铜酚络合溶液的比色皿放入样品束中。然后收集金属配体配合物的吸收光谱。之后，在铜-酚复合物溶液中加入化学计量量的肽，轻轻地上下管道使其充分混合，同时注意不要引入任何气泡。
接下来，将溶液孵育五分钟以达到平衡。将比色皿放回样品池支架中并记录吸收光谱。之后，重复将肽等分试样添加到铜酚复合物溶液中以获取各种当量，并记录添加的肽体积，以便确定稀释浓度。
首先打开 ITC 并启动 ITC 软件以运行仪器。第一次初始化后，重新连接滴定管并按照屏幕上的说明进行操作。然后从参考单元中取下滴定管和盖子。
接下来，从参比池中取出任何水，并用 450 微升脱气超纯水冲洗三次。慢慢地将超纯水抽取至装载注射器的 450 微升标记，注意不要将气泡引入注射器。然后将加载注射器插入参比池中，直到它距离底部约一毫米，然后缓慢注入部分溶液，直到加载注射器中残留150微升。
之后，将装载注射器柱塞快速上下移动约25微升数次，以去除细胞表面上的任何气泡。然后缓慢注射，直到柱塞达到加载注射器上的100微升标记，从而将总共350微升超纯水分配到参比池中并更换参比池盖。从样品池中取出任何残留溶液后，使用上样注射器加载 450 μL 10 毫摩尔 EDTA 并浸泡 10 分钟以确保去除痕量金属离子，因为 EDTA 会结合痕量金属。
取出EDTA溶液后，用大量超纯水彻底冲洗装载注射器。按照制造商的说明，用超纯水冲洗样品池，清洁ITC。从样品池中除去任何残留的水，然后用450微升缓冲液冲洗至少三次来调节样品池。
接下来，去除正在调节样品池的残留缓冲液，并使用上样注射器将肽溶液加载到样品池中。然后首先取出柱塞，用200微升缓冲溶液冲洗滴定注射器。使用微量移液器，将缓冲溶液移液通过玻璃滴定注射器顶部的孔穿过注射器并排出下面的针头。
之后，将柱塞完全插入滴定注射器。然后将滴定注射器针头的尖端浸入金属溶液中，然后缓慢向上拉动柱塞，使金属溶液充满注射器，并在滴定注射器的玻璃部分顶部产生空隙体积。要去除空隙体积，请平行于地板旋转滴定注射器。
然后拆下柱塞，将玻璃部分稍微倾斜到地板上。轻轻摇动滴定注射器，使溶液移动到滴定注射器的玻璃部分并填充大部分空隙体积。但请确保保留两到三微升的空隙体积。
在保持注射器与地板平行的同时，重新插入柱塞。然后直立握住滴定注射器，将针尖浸入金属溶液中。接下来，向下推动柱塞，直到空气停止从针头中流出，并通过缓慢地将柱塞拉到略高于 50 微升标记，同时将针尖保持在溶液中来加载滴定注射器。
小心地将滴定注射器的玻璃部分插入滴定管并拧紧直至手指拧紧。之后，使用轻型精密刮水器吸收由于柱塞压缩而从滴定注射器流出的溶液，而不会接触针尖。接下来，用滴定注射器将滴定管插入样品池并牢固固定。
要设置 ITC 软件的参数，请选择仪器控制。设置搅拌速率和温度。然后在实验详细信息下，以毫摩尔为单位输入注射器和细胞浓度。
接下来，在“实验方法”部分中，选择“增量滴定”。单击设置并指定20次2.5微升的进样，如果需要更高的分辨率来观察结合事件，请增加进样次数并减少每次进样的体积。然后，输入每次进样之间的时间间隔，使其足够长，使信号平衡并返回到基线，通常为300秒。
然后单击“运行”按钮以启动实验并指定数据的保存位置。将Cu（II）滴定为C肽，证明添加150微摩尔的Cu（II）导致600纳米处的带立即增加，这归因于Cu（II）的d-d带，并继续增加，直到添加300毫摩尔Cu（II）。进一步添加300微摩尔Cu（II）不会增加d-d禁令的吸收，表明饱和度和Cu（II）在log K值大于6的1：1复合物中与C肽结合。
将C肽滴定为约10微摩尔铜-苯配合物，265纳米处电荷转移带的吸收降低，表明C肽能够从菲咯啉配体中螯合Cu（II），log K值为7.4至7.8。ITC 热图显示 1.4 毫摩尔 Cu（II） 在 15 毫摩尔 MOPS 缓冲液中滴定到 154 微摩尔 C 肽中。发现结合亲和力的log K值为8，焓的变化为每摩尔8千焦耳。
吉布斯自由能为每摩尔负46千焦耳，熵的变化为每摩尔每开尔文120焦耳。在没有 C 肽的情况下，将 1.4 毫摩尔 Cu（II） 滴入 15 毫摩尔 MOPS 缓冲液中，显示热图中没有结合。我会说确保一切都很干净。
如果有先前实验中残留的金属离子或肽，则会极大地影响化学计量，并在结合实验中提供未知的竞争。圆二色性是研究金属肽或金属蛋白相互作用的另一种方法，因为它着眼于手性。质谱法也可以通过观察质量的变化来询问这些复合物。
这套技术已被许多研究金属离子与肽或蛋白质相互作用的实验室使用。
