이 방법을 통해 연구원은 펩타이드 및 1열 전이 금속 이온과 같이 연구하기 어려운 시스템을 조사할 수 있으며, 둘 다 일반적으로 더 많은 표준 응용 분야를 사용하는 것이 어렵습니다. 여기서 가장 큰 장점은 직교 기술을 사용하여 서로를 잘 보완하고 시스템에 대한 더 많은 통찰력을 제공하고 현상을 놓치지 않도록 도와줍니다. 이 비디오에 자세히 설명 된 방법은 다른 시스템을 연구하는 데 매우 적합합니다.
Cu (II) 및 펩타이드로 보여 주지만 다양한 금속 펩타이드 및 금속 단백질 상호 작용에 사용할 수 있습니다. 가장 어려운 부분은 금속 이온과 펩타이드에 대한 좋은 버퍼 선택을 찾는 것입니다. 나는 이전에 다른 사람들이 어떤 버퍼를 사용했는지 알아보기 위해 문헌을 참조할 것입니다.
절차를 시연하는 것은 내 연구실의 대학원생 인 최소희입니다. 시작하려면 전자 흡수 분광 광도계를 켜고 사용하기 전에 약 15-20 분 동안 예열하십시오. 그런 다음 분광 광도계 소프트웨어를 실행하고 200-900 나노 미터의 스캔 범위, 초당 200 나노 미터의 스캔 범위 및 이중 빔 기준선 수정과 같은 매개 변수를 구성합니다.
다음으로, 빔 경로에 큐벳이나 샘플이 없는 기준선을 수집합니다. 이중 빔 분광 광도계에서 일치하는 두 개의 큐벳을 사용하여 큐벳에 115마이크로리터의 초순수가 들어오고 다른 큐벳에 115마이크로리터의 펩타이드 샘플을 로드하면서 큐벳에 기포가 없는지 확인합니다. 그런 다음 초순수가 있는 큐벳을 기준 빔에 놓고 펩타이드가 있는 큐벳을 샘플 빔에 놓습니다.
그런 다음 금속이없는 펩타이드의 흡수 스펙트럼을 수집합니다. 화학량론적 양의 Cu(II) 용액을 펩타이드 샘플이 있는 큐벳에 추가하고 나중에 분석할 수 있도록 부피를 기록합니다. 기포 생성을 피하면서 용액을 혼합하기 위해 위아래로 부드럽게 파이프하십시오.
5분 동안 평형을 이룬 후 큐벳을 샘플 셀 홀더에 다시 넣고 흡수 스펙트럼을 기록합니다. 그런 다음 다양한 당량에 대해 펩타이드 용액에 Cu (II) 부분 표본을 첨가하고 큐벳에 첨가 된 Cu (II)의 총 부피를 기록합니다. 앞에서 설명한 대로 소프트웨어를 초기화한 후 두 개의 일치하는 큐벳에 115마이크로리터의 초순수가 포함된 큐벳 1개와 115마이크로리터의 구리-펜 복합 용액이 있는 다른 큐벳을 로드합니다.
기준 빔에 물이 있는 큐벳을 놓고 샘플 빔에 구리-펜 복합 용액이 있는 큐벳을 놓습니다. 그런 다음 금속 리간드 복합체의 흡수 스펙트럼을 수집합니다. 그런 다음 구리-펜 복합 용액에 화학량론적 양의 펩타이드를 넣고 기포가 유입되지 않도록 주의하면서 위아래로 부드럽게 파이프하여 완전히 혼합합니다.
다음으로, 평형에 도달하기 위해 용액을 5 분 동안 배양한다. 큐벳을 샘플 셀 홀더에 다시 넣고 흡수 스펙트럼을 기록합니다. 나중에, 다양한 당량물에 대한 구리-펜 복합체 용액에 펩티드 분취량의 첨가를 반복하고, 희석된 농도가 결정될 수 있도록 첨가된 펩티드의 부피를 기록한다.
먼저 ITC를 켜고 ITC 소프트웨어를 실행하여 계측기를 실행합니다. 첫 번째 초기화 후 뷰렛을 다시 이동하고 화면의 지시를 따릅니다. 그런 다음 뷰렛과 덮개를 참조 셀에서 제거합니다.
그런 다음 기준 셀에서 물을 제거하고 450마이크로리터의 탈기된 초순수로 3회 헹굽니다. 주사기에 기포가 유입되지 않도록 주의하면서 로딩 주사기의 450마이크로리터 표시까지 초순수를 천천히 끌어올립니다. 그런 다음 로딩 주사기를 바닥에서 약 1mm가 될 때까지 기준 셀에 삽입하고 로딩 주사기에 150마이크로리터가 남을 때까지 용액의 일부를 천천히 주입합니다.
그런 다음 로딩 시린지 플런저를 약 25마이크로리터씩 빠르게 위아래로 여러 번 움직여 셀 표면의 기포를 제거합니다. 그런 다음 플런저가 로딩 주사기의 100마이크로리터 표시에 도달할 때까지 천천히 주입하여 총 350마이크로리터의 초순수를 기준 셀에 분주하고 기준 셀 덮개를 교체합니다. 샘플 셀에서 잔류 용액을 제거한 후 로딩 주사기를 사용하여 450마이크로리터의 10밀리몰 EDTA를 로드하고 EDTA가 미량 금속과 결합하므로 미량 금속 이온이 제거되도록 10분 동안 담가 둡니다.
EDTA 용액을 제거한 후 로딩 주사기를 다량의 초순수로 완전히 헹굽니다. 초순수로 샘플 셀을 헹구어 제조업체의 지침에 따라 ITC를 청소하십시오. 샘플 셀에서 잔류 물을 제거한 다음 450마이크로리터의 버퍼로 최소 3회 헹구어 샘플 셀을 컨디셔닝합니다.
다음으로, 샘플 셀을 컨디셔닝하는 잔류 완충액을 제거하고 로딩 주사기를 사용하여 샘플 셀 내로 펩티드 용액을 로딩한다. 그런 다음 먼저 플런저를 제거하여 200 마이크로 리터의 완충 용액으로 적정 주사기를 헹굽니다. 마이크로 피펫을 사용하여 유리 적정 주사기 상단의 구멍을 통해 완충 용액을 주사기를 통해 아래 바늘 밖으로 피펫팅합니다.
나중에 플런저를 적정 주사기에 완전히 삽입하십시오. 그런 다음 적정 주사기 바늘의 끝을 금속 용액에 담그고 플런저를 천천히 위로 당겨 금속 용액이 주사기를 채우고 적정 주사기의 유리 부분 상단에 빈 부피가 생깁니다. 공극 부피를 제거하려면 적정 주사기를 바닥과 평행하게 돌립니다.
그런 다음 플런저를 제거하고 유리 부분을 바닥쪽으로 약간 기울입니다. 용액이 적정 주사기의 유리 부분으로 이동하여 대부분의 공극 부피를 채우도록 적정 주사기를 부드럽게 흔듭니다. 그러나 2-3 마이크로 리터의 공극 부피가 남아 있는지 확인하십시오.
주사기를 바닥과 평행하게 유지하면서 플런저를 다시 삽입하십시오. 그런 다음 적정 주사기를 똑바로 잡고 바늘 끝을 금속 용액에 다시 담그십시오. 다음으로, 바늘에서 공기가 나오지 않을 때까지 플런저를 아래로 밀고 바늘 끝을 용액에 유지하면서 플런저를 50마이크로리터 표시 바로 위로 천천히 당겨 적정 주사기를 로드합니다.
적정 주사기의 유리 부분을 뷰렛에 조심스럽게 삽입하고 손가락이 조여질 때까지 조입니다. 그 후, 가벼운 섬세한 와이퍼를 사용하여 플런저의 압축으로 인해 적정 주사기에서 나오는 용액을 바늘 끝을 건드리지 않고 흡수합니다. 그런 다음 적정 주사기로 뷰렛을 샘플 셀에 삽입하고 단단히 고정합니다.
ITC 소프트웨어의 파라미터를 설정하려면 계측기 제어를 선택하십시오. 교반 속도와 온도를 설정합니다. 그런 다음 실험 세부 정보에서 주사기와 세포 농도를 밀리몰 단위로 입력합니다.
다음으로, 실험 방법 섹션에서 증분 적정을 선택합니다. 설정을 클릭하고 2.5 마이크로 리터의 20 회 주입을 지정하고 결합 이벤트를 관찰하기 위해 더 많은 분해능이 필요한 경우 주입 횟수를 늘리고 주입 당 부피를 줄입니다. 그런 다음 신호가 평형을 이루고 기준선으로 돌아갈 수 있을 만큼 충분히 길도록 각 주입 사이의 시간 간격(일반적으로 300초)을 입력합니다.
그런 다음 실행 단추를 클릭하여 실험을 시작하고 데이터가 저장되는 위치를 지정합니다. Cu (II)의 적정은 150 마이크로 몰의 Cu (II)의 첨가가 Cu (II)의 d-d 밴드에 기인 한 600 나노 미터의 밴드에서 즉각적인 증가를 일으켰으며 300 밀리몰 Cu (II)가 첨가 될 때까지 계속 증가한다는 것을 입증했다. 300 마이크로 몰 이상의 Cu (II)를 추가로 첨가해도 포화 상태를 나타내는 d-d 금지의 흡수가 증가하지 않았으며 Cu (II)는 log K 값이 6 이상인 1 : 1 복합체에서 C- 펩타이드에 결합합니다.
C-펩타이드는 약 10 마이크로 몰 구리-펜 복합체로 적정되었고 265 나노 미터에서 전하 전달 밴드로부터의 흡수는 감소하여 C- 펩타이드가 7.4에서 7.8의 log K 값을 갖는 페난 트롤린 리간드로부터 Cu (II)를 킬레이트 할 수 있음을 나타냅니다. ITC 서모그램은 15밀리몰 MOPS 완충액에서 1.4밀리몰 Cu(II)를 154마이크로몰 C-펩타이드로 적정한 것을 보여줍니다. 결합 친화도는 몰당 8 킬로 줄로서 엔탈피의 변화와 함께 8의 log K 값을 갖는 것으로 밝혀졌다.
Gibbs는 자유 에너지를 몰당 마이너스 46킬로줄로, 엔트로피의 변화는 켈빈당 몰당 120줄입니다. C-펩타이드가 없는 상태에서 15밀리몰 MOPS 완충액으로 1.4밀리몰 Cu(II)를 조절하여 적정한 결과 서모그램에서 결합이 나타나지 않습니다. 나는 모든 것이 깨끗한 지 확인한다고 말할 것입니다.
이전 실험에서 남은 금속 이온이나 펩타이드가 있으면 화학량론에 큰 영향을 미치고 결합 실험에서 알려지지 않은 경쟁을 제공할 수 있습니다. 원형 이색성은 키랄성을 보기 때문에 금속 펩타이드 또는 금속 단백질 상호 작용을 연구하는 또 다른 방법입니다. 질량 분석법은 또한 질량의 변화를 관찰하여 이러한 복합체를 조사할 수 있습니다.
이 기술 세트는 펩타이드 또는 단백질과 상호 작용하는 금속 이온을 연구하는 많은 실험실에서 사용되었습니다.
