PIB-MS是一种新技术，用于富集内源性磷酸蛋白磷酸酶，并且它们与来自细胞和组织的蛋白质相互作用。它涉及使用基于质谱的蛋白质组学对这些蛋白质进行鉴定和定量。该技术不需要标记版本的磷蛋白磷酸酶的外源性表达，这些版本可以改变蛋白质活性或定位。
此外，它不使用可能非特异性或无法区分特定亚型的抗体。这种研究PPPM的方法可以扩展用于从细胞到临床样品的所有方面。首先，通过在室温下以277次g离心两分钟来收集细胞沉淀。
取出培养基并用5毫升PBS洗涤细胞。按照文本协议中所述准备裂解缓冲液并保持在冰上。向样品中加入一毫升冷冻裂解缓冲液，然后通过超声处理使样品均质化，并将细胞保持在脉冲之间的冰上。
将裂解物转移到新鲜的1.5毫升管中。将超声处理的样品以21，130倍g在4摄氏度下离心15分钟。使用裂解物的等分试样使用双新角蛋白酸测定法量化总蛋白浓度。
此步骤对于确保每个样品中的蛋白质浓度相等至关重要。对于磷酸蛋白磷酸酶抑制剂控制，为每个样品制备两个等同一蛋白质浓度的等分试样。裂解缓冲液可用于稀释样品，使每个试管具有相等的蛋白质浓度。
向一个等分试样中加入一微摩尔游离微囊藻素-LR，向另一个等分试样加入等体积的DMSO。涡旋样品并将其在冰上孵育15分钟。磷酸酶抑制剂磁珠的制备应提前或在样品制备部分中描述的孵育步骤中进行。
使用10微升固体磷酸酶抑制剂珠或PIB树脂，用于一毫克蛋白质，并将它们加入1.5毫升管中。用0.5毫升裂解缓冲液涡旋洗涤PIB三次，然后在室温下以376倍g离心30秒。向洗涤的PIB中加入适量的裂解缓冲液，以制成50%体积的PIB缓冲液。
通过轻轻移液混合并旋转移液器尖端和浆料以重悬PIB。将20微升浆液转移到含有0.5毫升裂解缓冲液的1.5毫升管中。以376次g旋转管30秒。
每个管子中含有等体积的PIB。丢弃上清液，同时在每个管中仅留下固体树脂和最多50微升的裂解缓冲液。将裂解物转移到含有PIB的适当标记的管中。
将裂解物与PIB一起在4摄氏度下孵育一小时，以8 rpm的速度旋转。与裂解物孵育后，在4摄氏度下以376倍g离心PIB30秒并除去上清液。通过加入0.5毫升裂解缓冲液并倒置管来洗涤磁珠通过离心收集磁珠并除去上清液。
重复此步骤，总共洗涤三次。最终洗涤后，尽可能多地去除裂解缓冲液，而无需移取PIB。制备含有2%SDS的洗脱缓冲液，并加入洗脱缓冲液4至5倍于PIB体积。
在65摄氏度下孵育一小时，以从磁珠中洗脱磷酸蛋白磷酸酶。在室温下以376次g离心管30秒。将洗脱液收集到单独的管中，并进行质谱分析或蛋白质印迹。
要再生PIB，请将它们在2%SDS溶液中孵育，在室温下以8rpm旋转一小时。在25毫摩尔Tris-HCl pH 7.5下洗涤珠子三到五次，每次洗涤旋转30分钟。将PIB储存在25毫摩尔三元HCL pH 7.5和叠氮化钠中。
对于质谱分析，数据过滤和分析的方法各不相同，可以由研究人员或核心设施执行。针对特定物种的蛋白质组数据库搜索原始数据后，筛选搜索结果并将其导出为 Microsoft Excel 工作表。一式三份分析数据。
对于无标记定量，请使用 MS1 峰面积测量来量化数据。为了从头鉴定PPP亚基及其相互作用者，比较微囊藻毒素-LR抑制和DMSO处理的样品的生物一式三份。过滤数据，以便仅存在总肽计数超过三个DMSO对照处理样品中至少两分之一的蛋白质。
为了过滤掉与树脂非特异性结合的蛋白质，请去除微囊藻毒素-LR处理条件下总肽计数高于任何PPP催化亚基的蛋白质。从分析中排除常见的污染物，如角蛋白、胶原蛋白、核糖体蛋白和异质核糖核蛋白。CSV文件对于将数据导入英仙座至关重要。
通过单击“加载”部分中的“通用矩阵上传”，将筛选的数据导入英仙座。通过转到“基本转换”，选择数据并将转换函数指定为 x 的对数基数 2 来转换数据。通过转到插补、替换正态分布中的缺失值、选择数据并指定计算的宽度和下移，从正态分布中插补缺失值。
通过转到归一化、分位数规范化来执行分位数规范化。通过转到“注释行”、“分类注释行”来批注数据。通过转到测试，双样本测试，选择组，要执行的测试以及用于截断的多个假设测试校正方法来执行学生的T检验。
此函数还计算对数 2 比率。使用PIB下拉实验在HeLa细胞中鉴定磷酸化蛋白磷酸盐及其相互作用者，然后对DMSO处理和微囊藻毒素- LR处理的样品中的蛋白质丰度进行无标记定量。质谱分析的火山图鉴定出红色显示的特定PIB结合剂，蓝色显示催化亚基，白色显示新的候选PPP亚基或相互作用蛋白。
非特异性粘合剂以灰色显示。DMSO处理的HeLa细胞裂解物log2面积散点图显示，其丰度高度相关，表明数据的可重复性。对所有磷蛋白磷酸酶亚基和相互作用蛋白的网络分析表明，这些蛋白质是PIB下拉中的特异性相互作用物。
可以进行全球蛋白质组学分析，并将结果与PIB分析进行比较，以确定PPPome组成是由PPP丰度驱动的还是由翻译后机制调节的。PIB-MS是一种广泛适用的工具，使我们能够识别各种条件下PPP表达模式的差异，例如相间与有丝分裂样品或癌细胞系之间的差异。
