使用代谢标记和质谱法测量衰老和非分裂培养细胞中的蛋白质周转率

在细胞应激和衰老的背景下，细胞如何维持蛋白质稳态尚不清楚。在该协议中，我们提供了一种简单准确的方法来计算蛋白质周转，这是活细胞中蛋白质稳态的关键组成部分。Pulse SILAC使实验人员能够以高通量方式测量单个蛋白质和整个蛋白质组的蛋白质周转，这比其他方法对生物系统也更真实。

这种方法的原理可以应用于任何可以代谢标记的系统，包括整个生物体。这种方法还可以导致对细胞衰老，衰老和神经退行性疾病的见解。质谱分析对某些化学污染物（如洗涤剂）高度敏感。

在整个过程中使用LC-MS级试剂，以确保高质量的数据收集。要开始细胞的代谢标记，请用30毫升SILAC轻介质替换衰老细胞和静止细胞的三个板的培养基。另外，将三个衰老板和三个静态板的培养基更换为30毫升SILAC Heavy。

在不改变培养基的情况下培养细胞三天。为了将细胞从培养板中分离，在每个板中加入五毫升预热的胰蛋白酶试剂，并将板在37摄氏度下孵育五分钟。之后，将分离的细胞重悬于用于培养的相同培养基的五毫升中，总体积为10毫升。

接下来，将细胞转移到冰上，并在四摄氏度下以300倍G离心细胞。洗涤沉淀两次后，再次旋转细胞并除去上清液，然后将沉淀重悬于150微升新鲜制备的八摩尔尿素和50毫摩尔碳酸氢铵裂解缓冲液中。通过上下移液混合管的内容物。

将50微克蛋白质样品等分到新管中，并用裂解缓冲液将样品提高到等体积。然后将二硫代噻嗪醇加入到最终浓度为20毫摩尔的试管中，并将样品在37摄氏度下振荡30分钟。让样品在室温下冷却10分钟，然后将碘乙酰胺加入到最终浓度为40毫摩尔，并在室温下在黑暗中孵育30分钟。

然后用50毫摩尔碳酸氢铵缓冲液将样品稀释至低于一摩尔尿素。在样品中加入一微克胰蛋白酶作为50微克起始蛋白或胰蛋白酶与蛋白质的比例为1:50。将样品在37摄氏度下孵育过夜，摇卝将蛋白质消化成肽。

第二天，加入甲酸至样品体积的1%以淬灭蛋白质消化。对于样品清理，根据制造商的指南，将固相萃取盒放在真空歧管上，每个样品使用一个萃取筒。提取后，从真空歧管中取出肽样品，并在真空浓缩器中完全干燥。

干燥大约需要三个小时。对于质谱或MS分析，将肽样品以每微升400纳克的浓度重悬于0.2%甲酸缓冲液中。要重新溶解肽，将样品混合五分钟。

然后，在水浴超声仪中超声处理五分钟。然后，离心样品以沉淀不溶性物质并将肽上清液转移到MS小瓶中。使用液相色谱串联质谱或LC-MS-MS提交样品进行蛋白质组学分析。

使用质谱机构为非靶向分析推荐的设置。将样品加载到流速为每分钟400纳升的分析柱上，使用有机和无机溶剂的混合物在90分钟的线性梯度上洗脱肽，有机溶剂范围为5%至35%以数据依赖模式获取质谱数据，连续循环MS1调查扫描，然后进行20次数据依赖性MS2扫描，HCD片段化。在蛋白质组定量软件工具中定量重肽和轻肽的肽峰区域。

然后，输出重肽和轻肽峰区。要计算蛋白质半衰期，请打开SILAC分析工作簿到第一个名为Raw Data的工作表，并将UniProt ID，基因名称，重峰和轻峰区域粘贴到指示的列中。然后，打开名为"分析"的第四个工作表，并删除列 G 和 H 指示样本超出范围的行，并将读取的行保留在该范围内。

使用衰老相关的β-半乳糖苷酶活性和RT-qPCR分析验证衰老表型。对于β-半乳糖苷酶活性，衰老细胞呈蓝色，而静止对照细胞没有或颜色极小。在RT-qPCR分析中，与静止细胞相比，衰老细胞显示出更高的白细胞介素-6，CXCL8和CDKN1A-P21 mRNA。

相反，编码增殖标志物的层粘连蛋白B1水平在衰老细胞中较低或不存在。提取的肽离子色谱图揭示了重肽和轻肽信号的相对比例。相对于轻衰老细胞，重肽信号的比例较低，表明蛋白质周转率较慢，而相对于光的重肽信号较高，表明蛋白质周转率更快。

未标记的样品显示很少或没有重肽信号。计算从质谱分析中鉴定的695种蛋白质的半衰期。半衰期被报告为衰老与静止细胞的对数二比，并绘制在火山图中。

在计算衰老细胞的蛋白质周转率之后，下游分析可能会揭示由蛋白质平衡机制调节的候选生物学途径。Pulse SILAC为研究人员以前所未有的粒度和通量研究蛋白质动力学铺平了道路，使我们能够研究许多单个蛋白质中蛋白质稳态的变化。