Como as células mantêm a homeostase proteica não é bem compreendida no contexto do estresse celular e da senescência. Neste protocolo, fornecemos uma maneira simples e precisa de calcular a rotatividade de proteínas, que é um componente-chave da homeostase proteica em células vivas. Pulse SILAC dá a um experimentador a capacidade de medir a rotatividade de proteínas para proteínas individuais e todo o proteome de uma maneira de alto rendimento que também é mais autêntico para sistemas biológicos do que outros métodos.
Os princípios deste método podem ser aplicados a qualquer sistema que possa ser rotulado metabolicamente, incluindo organismos inteiros. Esse método também pode levar a insights sobre senescência celular, envelhecimento e doenças neurodegenerativas. A análise de espectrometria em massa é altamente sensível a certos contaminantes químicos, como detergentes.
Use reagentes de grau LC-MS durante este procedimento para garantir a coleta de dados de alta qualidade. Para iniciar a rotulagem metabólica das células, substitua a mídia por três placas cada uma das células senescentes e quiescentes por 30 mililitros de mídia SILAC Light. Separadamente, substitua o médio por três placas senescentes e três quiescentes por 30 mililitros de SILAC Heavy.
Cresça as células por três dias sem mudar o meio. Para separar as células das placas de cultura, adicione cinco mililitros de reagente de trippsina pré-aquecido a cada placa e incubar as placas por cinco minutos a 37 graus Celsius. Mais tarde, resuspende as células separadas em cinco mililitros da mesma mídia usada para a cultura para um volume total de 10 mililitros.
Em seguida, transfira as células para o gelo e centrifugar as células a 300 vezes G a quatro graus Celsius. Depois de lavar a pelota duas vezes, gire as células novamente e remova o supernasciente antes de reutilizar a pelota em 150 microliters de ureia de oito molares recém-preparada e 50 milimônios tampão de bicarbonato de bicarbonato. Misture o conteúdo do tubo por tubulação para cima e para baixo.
Alíquota de 50 microgramas da amostra de proteína em um novo tubo e leva amostras a volumes iguais com tampão de lise. Em seguida, adicione dithiothreitol a uma concentração final de 20 milimôlares ao tubo e incubar a amostra a 37 graus Celsius por 30 minutos com agitação. Deixe a amostra esfriar à temperatura ambiente por 10 minutos antes de adicionar iodoacetamida a uma concentração final de 40 mililitros e incubar à temperatura ambiente no escuro por 30 minutos.
Em seguida, dilua a amostra para abaixo de uma ureia molar com um tampão de bicarbonato de amônio de 50 mililolar. Adicione um micrograma de trippsina para 50 microgramas de proteína inicial ou às 1:50 trippsina à razão proteica à amostra. Incubar a amostra durante a noite a 37 graus Celsius com agitação para digerir proteínas em peptídeos.
No dia seguinte, adicione ácido fórmico a 1% em volume da amostra para saciar a digestão proteica. Para a limpeza da amostra, coloque um cartucho de extração em fase sólida em um coletor de vácuo, utilizando um cartucho de extração para cada amostra, de acordo com as diretrizes do fabricante. Após a extração, remova as amostras de peptídeos do coletor de vácuo e seque-as completamente em um concentrador de vácuo.
A secagem leva aproximadamente três horas. Para a espectrometria de massa, ou análise de MS, resuspenque a amostra de peptídeo a uma concentração de 400 nanogramas por microliter em um buffer de ácido fórmico de 0,2%. Para resolubilizar os peptídeos, misture a amostra por cinco minutos.
Em seguida, sonicate por cinco minutos em um sonicator banho de água. Em seguida, centrifuufique a amostra para pelotar os materiais insolúveis e transfira os supernantes peptídeos em frascos de MS. Submeta as amostras para a análise proteômica usando espectrometria de massa cromatografia líquida tandem, ou LC-MS-MS.
Use as configurações recomendadas para análise não-fixada pela instalação de espectrometria de massa. Carregue as amostras em uma coluna analítica com uma taxa de fluxo de 400 nanolitadores por minuto para elute os peptídeos sobre um gradiente linear de 90 minutos usando uma mistura de solventes orgânicos e inorgânicos, com o solvente orgânico variando de 5 a 35% Adquira dados de espectrometria de massa no modo dependente de dados, com um ciclo contínuo de varreduras de pesquisa MS1 seguidas por 20 tomografias MS2 dependentes de dados com fragmento de HCD. Quantifique as áreas de pico de peptídeos para peptídeos pesados e leves na ferramenta de software Proteome Quantitation.
Em seguida, exporte as áreas de pico de peptídeos pesados e leves. Para o cálculo de meias-vidas proteicas, abra a Pasta de Trabalho de Análise SILAC para a primeira folha chamada Raw Data e cole nos IDs UniProt, nomes de genes, áreas de pico pesado e leve nas colunas indicadas. Em seguida, abra a quarta folha chamada Análise e remova as linhas onde as colunas G e H indicam que a amostra está fora de alcance e mantenha linhas que lêem dentro do intervalo.
Os fenótipos senescentes foram validados utilizando-se a atividade beta-galactosidase associada à senescência e a análise rt-qPCR. Para a atividade beta-galactosidase, as células senescentes pareciam azuis, enquanto as células de controle quiescente não tinham cor mínima ou mínima. Na análise RT-qPCR, as células senescentes apresentaram maior interleucina-6, CXCL8 e CDKN1A-P21 mRNAs em comparação com as células quiescentes.
Por outro lado, o nível de codificação lamin B1 para marcador de proliferação foi baixo ou ausente nas células senescentes. Os cromatogramas de íons extraídos de peptídeos revelaram a proporção relativa de sinais de peptídeos pesados e leves. Uma proporção menor de sinais de peptídeos pesados em relação às células senescentes leves indicaram uma taxa de rotatividade de proteínas mais lenta, e um sinal de peptídeo pesado mais alto em relação à luz indicou uma taxa de rotatividade de proteínas mais rápida.
As amostras não rotuladas mostraram pouco ou nenhum sinal de peptídeo pesado. Foram calculadas as meias-vidas para 695 proteínas identificadas a partir da análise de espectrometria de massa. A meia-vida é relatada como uma proporção de log-dois de senescente sobre células quiescentes e plotada em um complô vulcâneo.
Após o cálculo das taxas de rotatividade de proteínas em células senescentes, a análise a jusante pode revelar caminhos biológicos candidatos que são regulados por mecanismos de proteostase. O Pulse SILAC abriu caminho para os pesquisadores estudarem a dinâmica proteica com granularidade e throughput sem precedentes, permitindo-nos estudar mudanças na homeostase proteica em muitas proteínas individuais.
