האופן שבו תאים שומרים על הומאוסטזיס של חלבונים אינו מובן היטב בהקשר של לחץ תאי וסנסנציה. בפרוטוקול זה, אנו מספקים דרך פשוטה ומדויקת לחישוב תחלופת חלבונים, שהיא מרכיב מרכזי בהומאוסטזיס של חלבונים בתאים חיים. Pulse SILAC נותן לנסיין את היכולת למדוד תחלופת חלבונים עבור חלבונים בודדים והפרוטאום כולו באופן בעל תפוקה גבוהה שהוא גם אותנטי יותר למערכות ביולוגיות מאשר שיטות אחרות.
העקרונות של שיטה זו יכולים להיות מיושמים על כל מערכת שניתן לסמן מטבולית, כולל אורגניזמים שלמים. שיטה זו יכולה גם להוביל לתובנות על סנסנציה תאית, הזדקנות ומחלות נוירודגנרטיביות. ניתוח ספקטרומטריית מסה רגיש מאוד למזהמים כימיים מסוימים, כגון דטרגנטים.
השתמש בריאגנטים ברמת LC-MS לאורך כל ההליך הזה כדי להבטיח איסוף נתונים באיכות גבוהה. כדי להתחיל את הסימון המטבולי של התאים, החלף את המדיה עבור שלוש צלחות כל אחת של תאים senescent ו quiescent עם 30 מיליליטרים של SILAC אור מדיה. בנפרד, החלף את המדיום לשלושה לוחות סנסנט ושלושה לוחות קווסנטיים ב-30 מיליליטרים של SILAC Heavy.
לגדל את התאים במשך שלושה ימים מבלי לשנות את המדיום. כדי לנתק את התאים מלוחות התרבית, הוסיפו חמישה מיליליטרים של מגיב טריפסין שחומם מראש לכל צלחת ודגרו את הלוחות במשך חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. מאוחר יותר, החייאת התאים המנותקים בחמישה מיליליטרים של אותה מדיה המשמשת לתרבית לנפח כולל של 10 מיליליטרים.
לאחר מכן, העבירו את התאים לקרח וצנטריפוגות התאים ב-300 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס. לאחר שטיפת הכדור פעמיים, סובבו שוב את התאים והסירו את הסופרנאטנט לפני החייאה של הכדור ב-150 מיקרוליטרים של אוריאה בת שמונה טוחנים שהוכנו זה עתה ו-50 מילימולר אמוניום ביקרבונט ליזה. מערבבים את תכולת הצינור על ידי צנרת למעלה ולמטה.
Aliquot 50 מיקרוגרם של דגימת החלבון לתוך צינור חדש ומביא דגימות לנפחים שווים עם מאגר ליזיס. לאחר מכן מוסיפים את dithiothreitol לריכוז סופי של 20 מילימולר לצינור ודגירה של הדגימה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם רעידות. אפשרו לדגימה להתקרר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות לפני הוספת יודואצטאמיד לריכוז סופי של 40 מילימולאר ודגירה בטמפרטורת החדר בחושך למשך 30 דקות.
לאחר מכן דיללו את הדגימה אל מתחת לאוריאה טוחנת אחת עם חיץ אמוניום ביקרבונט של 50 מילימולאר. הוסיפו מיקרוגרם אחד של טריפסין ל-50 מיקרוגרם של חלבון מתחיל או ביחס של 1:50 טריפסין לחלבון לדגימה. דגירו את הדגימה למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם רעידות לעיכול חלבונים לפפטידים.
למחרת, הוסיפו חומצה פורמית ל-1% לפי נפח הדגימה כדי להרוות את עיכול החלבון. לניקוי הדגימה, הניחו מחסנית מיצוי בפאזה מוצקה על סעפת ואקום, באמצעות מחסנית חילוץ אחת לכל דגימה, בהתאם להנחיות היצרן. לאחר המיצוי, הסר את דגימות הפפטידים מסעפת הוואקום וייבש אותן לחלוטין ברכז ואקום.
הייבוש אורך כשלוש שעות. עבור ספקטרומטריית המסה, או ניתוח MS, בצעו החייאה של דגימת הפפטיד בריכוז של 400 ננוגרם למיקרוליטר במאגר חומצה פורמית של 0.2%. כדי להרגיע מחדש את הפפטידים, יש לערבב את הדגימה במשך חמש דקות.
לאחר מכן, sonicate במשך חמש דקות ב sonicator אמבט מים. לאחר מכן, צנטריפוגה של הדגימה כדי להעיף את החומרים הבלתי מסיסים ולהעביר את הסופרנטנטים הפפטידיים לבקבוקוני MS. שלח את הדגימות לניתוח פרוטאומי באמצעות ספקטרומטריית מסה טנדם כרומטוגרפית נוזלית, או LC-MS-MS.
השתמש בהגדרות המומלצות לניתוח לא ממוקד על ידי מתקן ספקטרומטריית המסות. טען את הדגימות על עמודה אנליטית עם קצב זרימה של 400 ננוליטרים לדקה כדי לרתום את הפפטידים על פני גרדיאנט ליניארי של 90 דקות באמצעות תערובת של ממסים אורגניים ואנאורגניים, כאשר הממס האורגני נע בין 5% ל-35% רכישת נתוני ספקטרומטריית מסה במצב תלוי נתונים, עם מחזור רציף של סריקות סקר MS1 ואחריו 20 סריקות MS2 תלויות נתונים עם פיצול HCD. לכמת את אזורי השיא של הפפטידים עבור פפטידים כבדים וקלים בכלי תוכנה לכמות פרוטאום.
לאחר מכן, ייצאו את אזורי השיא הפפטידיים הכבדים והקלים. לחישוב זמן מחצית החיים של החלבון, פתח את חוברת העבודה של ניתוח SILAC לגיליון הראשון בשם Raw Data והדבק במזהי UniProt, שמות גנים, אזורי שיא כבדים וקלים בעמודות שצוינו. לאחר מכן, פתח את הגיליון הרביעי בשם Analysis והסר את השורות שבהן העמודות G ו- H מציינות שהמדגם נמצא מחוץ לטווח ושמור שורות הנקראות בטווח.
הפנוטיפים הסנסנטיים אומתו באמצעות פעילות בטא-גלקטוזידאז הקשורה לסנסנציה וניתוח RT-qPCR. עבור פעילות הבטא-גלקטוזידאז, התאים הסנסנטיים נראו כחולים, בעוד שלתאי הבקרה הקוויזנטיים לא היה צבע או צבע מינימלי. בניתוח RT-qPCR, התאים הסנסנטיים הציגו אינטרלוקין-6, CXCL8 ו-CDKN1A-P21 mRNA גבוהים יותר בהשוואה לתאים הסוערים.
לעומת זאת, רמת הקידוד של lamin B1 עבור סמן התפשטות הייתה נמוכה או נעדרה בתאי הסנסציה. כרומטוגרמות היונים שחולצו של פפטידים חשפו את היחס היחסי של אותות פפטידים כבדים וקלים. שיעור נמוך יותר של אותות פפטידים כבדים ביחס לתאים סנסנטיים קלים הצביע על קצב תחלופה איטי יותר של חלבונים, ואות פפטיד כבד גבוה יותר ביחס לאור הצביע על קצב תחלופת חלבונים מהיר יותר.
הדגימות ללא תווית הראו מעט אות פפטידי כבד, אם בכלל. חושבו זמן מחצית החיים של 695 חלבונים שזוהו מניתוח ספקטרומטריית המסות. מחצית החיים מדווחת כיחס של לוג-שתיים של סנסנט על פני תאים שקטים ומתוותת בחלקת הר געש.
לאחר חישוב שיעורי תחלופת החלבון בתאים סנסנטיים, ניתוח במורד הזרם עשוי לחשוף מסלולים ביולוגיים מועמדים המווסתים על ידי מנגנוני פרוטאוסטזיס. Pulse SILAC סלל את הדרך לחוקרים לחקור דינמיקה של חלבונים עם גרעיניות ותפוקה חסרות תקדים, מה שאפשר לנו לחקור שינויים בהומאוסטזיס של חלבונים בחלבונים בודדים רבים.
