Hücrelerin protein homeostazını nasıl koruduğu, hücresel stres ve yaşlanma bağlamında iyi anlaşılmamıştır. Bu protokolde, canlı hücrelerde protein homeostazının önemli bir bileşeni olan protein döngüsünü hesaplamak için basit ve doğru bir yol sunuyoruz. Pulse SILAC, bir deneyciye bireysel proteinler ve tüm proteom için protein döngüsünü, biyolojik sistemlere diğer yöntemlerden daha otantik olan yüksek verimli bir şekilde ölçme yeteneği verir.
Bu yöntemin ilkeleri, tüm organizmalar da dahil olmak üzere metabolik olarak etiketlenebilen herhangi bir sisteme uygulanabilir. Bu yöntem aynı zamanda hücresel yaşlanma, yaşlanma ve nörodejeneratif hastalık hakkında içgörülere yol açabilir. Kütle-spektrometri analizi, deterjanlar gibi bazı kimyasal kirleticilere karşı oldukça hassastır.
Yüksek kaliteli veri toplama sağlamak için bu prosedür boyunca LC-MS sınıfı reaktifler kullanın. Hücrelerin metabolik etiketlemesine başlamak için, yaşlanan ve sessiz hücrelerin her biri için üç plaka için medyayı 30 mililitre SILAC Light ortamı ile değiştirin. Ayrı olarak, üç yaşlanan ve üç sessiz plaka için ortamı 30 mililitre SILAC Heavy ile değiştirin.
Ortamı değiştirmeden hücreleri üç gün boyunca büyütün. Hücreleri kültür plakalarından ayırmak için, her plakaya beş mililitre önceden ısıtılmış tripsin reaktifi ekleyin ve plakaları 37 santigrat derecede beş dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, ayrılan hücreleri, kültür için kullanılan aynı ortamın beş mililitresinde toplam 10 mililitre hacme kadar yeniden askıya alın.
Daha sonra, hücreleri buza aktarın ve hücreleri dört santigrat derecede 300 kez G'de santrifüj yapın. Peleti iki kez yıkadıktan sonra, hücreleri tekrar döndürün ve peleti 150 mikrolitre taze hazırlanmış sekiz molar üre ve 50 milimolar amonyum bikarbonat lizis tamponunda yeniden askıya almadan önce süpernatantı çıkarın. Tüpün içeriğini yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
Aliquot 50 mikrogram protein numunesini yeni bir tüpe dönüştürür ve numuneleri lizis tamponu ile eşit hacimlere getirir. Daha sonra tüpe 20 milimolar nihai konsantrasyona dithiothreitol ekleyin ve numuneyi sallayarak 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. 40 milimolarlık son konsantrasyona iyodoasetamid eklemeden ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe etmeden önce numunenin oda sıcaklığında 10 dakika soğumasını bekleyin.
Daha sonra numuneyi 50 milimolar amonyum bikarbonat tamponu ile bir molar ürenin altına seyreltin. 50 mikrogram başlangıç proteini için veya numuneye 1:50 tripsin / protein oranında bir mikrogram tripsin ekleyin. Numuneyi gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin, proteinleri peptitlere sindirmek için sallayın.
Ertesi gün, protein sindirimini söndürmek için numunenin hacmine göre% 1'e formik asit ekleyin. Numune temizliği için, üreticinin yönergelerine uygun olarak, her numune için bir ekstraksiyon kartuşu kullanarak, bir vakum manifoldu üzerine katı fazlı bir ekstraksiyon kartuşu yerleştirin. Ekstraksiyondan sonra, peptit numunelerini vakum manifoldundan çıkarın ve bir vakum yoğunlaştırıcısında tamamen kurulayın.
Kurutma yaklaşık üç saat sürer. Kütle spektrometrisi veya MS analizi için, peptid numunesini% 0.2'lik bir formik asit tamponunda mikrolitre başına 400 nanogram konsantrasyonunda yeniden askıya alın. Peptitleri çözündürmek için, numuneyi beş dakika karıştırın.
Ardından, bir su banyosu sonicator'da beş dakika boyunca sonikleştirin. Daha sonra, çözünmeyen malzemeleri peletlemek için numuneyi santrifüj edin ve peptid süpernatantlarını MS şişelerine aktarın. Sıvı kromatografisi tandem kütle spektrometrisi veya LC-MS-MS kullanarak proteomik analiz için numuneleri gönderin.
Kütle spektrometresi tesisi tarafından hedeflenmemiş analiz için önerilen ayarları kullanın. Peptitleri organik ve inorganik çözücülerin bir karışımı kullanarak 90 dakikalık doğrusal bir gradyan üzerinde süzmek için numuneleri dakikada 400 nanolitre akış hızına sahip analitik bir sütuna yükleyin, organik çözücü% 5 ila% 35 arasında değişir Kütle spektrometrisi verilerini veriye bağımlı modda, sürekli bir MS1 anket taraması döngüsü ve ardından HCD parçalanması ile 20 veriye bağımlı MS2 taraması elde edin. Proteom Quantitation yazılım aracında ağır ve hafif peptidler için peptid tepe alanlarını ölçün.
Ardından, ağır ve hafif peptit tepe bölgelerini dışa aktarın. Protein yarılanma ömürlerinin hesaplanması için, SILAC Analiz Çalışma Kitabını Ham Veri adlı ilk sayfaya açın ve UniProt ID'lerini, gen adlarını, ağır ve hafif tepe alanlarını belirtilen sütunlara yapıştırın. Ardından, Çözümleme adlı dördüncü sayfayı açın ve G ve H sütunlarının örneğin aralık dışında olduğunu gösterdiği satırları kaldırın ve aralık içinde okuyan satırları tutun.
Yaşlanan fenotipler, yaşlanma ile ilişkili beta-galaktosidaz aktivitesi ve RT-qPCR analizi kullanılarak doğrulandı. Beta-galaktosidaz aktivitesi için, yaşlanan hücreler mavi görünürken, sessiz kontrol hücreleri hiç renge sahip değildi veya minimal renge sahipti. RT-qPCR analizinde, yaşlanan hücreler, sessiz hücrelere kıyasla daha yüksek interlökin-6, CXCL8 ve CDKN1A-P21 mRNA'ları gösterdi.
Tersine, proliferasyon belirteci için lamin B1 kodlama seviyesi, yaşlanan hücrelerde düşüktü veya yoktu. Peptitlerin ekstrakte edilen iyon kromatogramları, ağır ve hafif peptit sinyallerinin göreceli oranını ortaya çıkardı. Hafif yaşlanan hücrelere göre daha düşük bir ağır peptit sinyali oranı, daha yavaş bir protein devir hızına işaret etti ve ışığa göre daha yüksek bir ağır peptit sinyali, daha hızlı bir protein devir hızına işaret etti.
Etiketlenmemiş numuneler çok az veya hiç ağır peptit sinyali göstermedi. Kütle spektrometresi analizinden tanımlanan 695 proteinin yarı ömürleri hesaplandı. Yarılanma ömrü, sessiz hücreler üzerinde yaşlanan log-iki oranı olarak rapor edilir ve bir volkan grafiğinde çizilir.
Yaşlanan hücrelerde protein devir hızlarının hesaplanmasını takiben, aşağı akış analizi, proteostaz mekanizmaları tarafından düzenlenen aday biyolojik yolları ortaya çıkarabilir. Pulse SILAC, araştırmacıların protein dinamiklerini benzeri görülmemiş granülerlik ve verimle incelemelerinin yolunu açtı ve birçok bireysel proteinde protein homeostazındaki değişiklikleri incelememizi sağladı.
