分子和免疫技术在胃肠道间质瘤基因工程小鼠模型中

我们的方案描述了目前唯一使用的免疫活性小鼠模型GIST的育种，维护，解剖和标本处理。我们希望未来的研究人员能够利用这种小鼠模型，以便在GIST中进一步进行转化研究。GIST的传统疗法包括使用酪氨酸激酶抑制剂进行靶向分子治疗。

该模型使研究人员能够在GIST中测试免疫疗法。首先，对所有器械进行消毒，在整个过程中戴上手套，并保持无菌状态。用70%乙醇准备切口区域。

用剪刀做一个两厘米的中线垂直切口，进入腹腔。锐利地裂开任何腹腔内粘连。要切除引流肠系膜淋巴结，请识别盲肠并上位抬高其肠系膜。

大约在结肠肠系膜底部的中间，识别肠系膜淋巴结并急剧解剖。根据需要，将淋巴结组织分成三分之一，用于蛋白质分离、组织学和单细胞悬浮液。将淋巴结组织置于20毫升RPMI培养基中以进行单细胞悬浮液并保持在冰上。

盲肠在Kit558小鼠中大多被GIST取代。为了分离GIST和盲肠，小心地将回肠结肠连接处与肿瘤的底部分开。然后，再次将盲肠分开，在肿瘤基部远端两厘米处。

在50%至60%的Kit558小鼠中，肿瘤的头部含有盲肠组织的盖子，其通常含有浆液，但可能很少含有脓液。尖锐地解剖帽状组织，使其远离肿瘤组织。将肿瘤组织和盲肠分成三部分，用于蛋白质分离、组织学和单细胞悬浮液。

对于单细胞悬浮液，将肿瘤组织或盲肠置于含有2%FCS的HBSS中，足以覆盖样品，并保持在冰上。将RPMI培养基与淋巴结标本一起倒入100微米过滤器上。将过滤器移动到新的50毫升圆锥形，并用三毫升塑料注射器的软端捣碎淋巴结。

用 20 毫升 RPMI 介质清洗过滤器。离心样品并吸出上清液。将沉淀重悬于20毫升珠缓冲液中，并倒在40微米过滤器上。

收集细胞滤液。使用血细胞计数器计数细胞。离心样品并弃去上清液。

然后，重悬于磁珠缓冲液中以进行流式细胞术。按照文本手稿中所述制备胶原酶缓冲液。将GIST放入无菌皿中，加入2.5毫升胶原酶缓冲液。

使用无菌手术刀和剪刀，切碎肿瘤，直到它变成细小的碎片。使用大口径移液管将肿瘤和胶原酶吸入50毫升管中。以每分钟100转的速度在37摄氏度下孵育30分钟，然后用两毫升FBS淬灭反应。

将胶原酶与GIST标本一起倒在100微米的过滤器上，并用三毫升塑料注射器的软端捣碎肿瘤并收集在50毫升管中。用20毫升HBSS清洗过滤器。将滤液在450 RCF下在四摄氏度下离心五分钟，然后弃去上清液。

将沉淀重悬于20毫升珠缓冲液中，倒在40微米过滤器上收集滤液并使用血细胞计数器计数细胞。离心并吸出上清液，然后重悬于磁珠缓冲液中以进行流式细胞术。使用剪刀，纵向分开盲肠以暴露内粘膜。

将其切成0.5厘米的部分，并将其放入50毫升的管中，其中含有5毫升的HBSS和2%的FBS。剧烈摇晃30秒，以450 RCF离心20秒。然后，丢弃上清液。

加入 5 至 20 毫升 HBSS 和 2 毫摩尔 EDTA。在37摄氏度下以每分钟100转的速度孵育15分钟。离心并弃去上清液，然后将沉淀重悬于5至20毫升HBSS中。

剧烈摇动混合物30秒，然后在450 RCF下离心20秒，弃去上清液。再次重复此过程。将沉淀重悬于5毫升胶原酶缓冲液中，然后在37摄氏度下以每分钟100转的速度孵育30分钟。

每10分钟剧烈摇动一次，并用两毫升FBS淬灭反应。将胶原蛋白酶与盲肠标本倒在100微米的过滤器上，并用三毫升塑料注射器的软端捣碎。用20毫升HBSS洗涤过滤器并收集滤液。

离心并弃去上清液。将沉淀重悬于20毫升珠缓冲液中，并倒在40微米过滤器上。收集滤液并使用血细胞计数器计数细胞。

再次重复离心过程，并将沉淀重悬于珠缓冲液中以进行流式细胞术。由于进行性肠梗阻，Kit558小鼠的平均寿命为八个月。来自Kit558小鼠的肿瘤表达GIST的规范标志物，包括酪氨酸激酶KIT，跨膜通道Dog1和转录因子ETV1。

研究了肿瘤中KIT信号通路的变化，例如下游标志物ERK和AKT或免疫微环境，其密切模仿人类GIST。MRI或CT用于跟踪肿瘤体积，作为肿瘤反应的准确测量。将肿瘤从回肠结肠连接处和盲肠帽剥离对于捕获真正的肿瘤重量以及免疫和分子分析非常重要。

在GIST中，该模型允许研究肿瘤微环境以及免疫疗法。