使用腺相关病毒-Cas9系统在Vitro建立基因工程的毛因头和颈部癌细胞系

该协议使头部和颈部癌症模型的发展与特定的基因组操作，显著影响我们了解特定基因突变在肿瘤过程中的作用。这种技术的主要优点是细胞系的易用性可以从几乎任何器官发展。演示程序将是马努普拉萨德一个研究生从我的实验室。

首先使用手术剪刀从六周大的雄性或雌性B6转基因小鼠的舌头收获。使用手术刀将组织切碎成非常小的碎片，并收集成含有4.5毫升RPMI纯介质的15毫升管，不含血清。将200微升三重酶混合物加入管中，在37摄氏度下孵育样品，每10分钟敲击10分钟，敲击管子，增强组织的酶分离。

在孵育结束时，停止PBS中5%FBS的反应，并通过70微米网状滤网过滤细胞悬浮液，将细胞从较大的组织片段中分离。通过离心收集细胞，并在三毫升完整介质中重新悬浮颗粒。然后将细胞板在三毫升完整的介质每16毫米盘。

将保留在过滤器顶部的细胞聚合转移到单独的 16 毫米培养盘上，并添加三毫升的完整介质。将两个盘子放在培养箱中，直到形成不同的细胞菌落。经过一周的培养，微观检查原细胞培养是否存在成纤维细胞污染，在37摄氏度的02%EDTA中用25%的三丁普辛治疗细胞一分钟，并去除任何成纤维细胞。

培养物的第10天在02%EDTA中使用25%的三至五分钟，在37摄氏度下从细胞悬浮液或细胞聚集培养物中采集细胞，并在每井两毫升的介质中看到两次10至第五个原细胞，进入6井板的每个井中。第二天，每毫升用10倍转导10至12个病毒基因组，并在37摄氏度下孵育含有病毒颗粒的介质中的细胞48小时。在孵化结束时，每井用两毫升新鲜完整培养基代替培养超级细胞，将细胞返回细胞培养箱。

经过两个星期的培养扩张，播种细胞进行验证和体内肿瘤生成实验。使用 AAV CAS9 载体，已确定每毫升病毒的 10 倍到 12 个病毒基因组，以便使用所证明的协议有效地将原发性冰毒细胞转化为肿瘤基因图谱。转导细胞表达克里、CAS9和绿色荧光蛋白。

注射五倍10至第五原 AAV 转导图到 NOD SCID 小鼠的舌头、嘴唇和皮肤，导致这些动物的肿瘤形成不同于初级图的注射，不会诱发肿瘤。通过免疫荧光和西印，可以确认原发性舌头上皮细胞的肿瘤原变。通过DNA深度测序进行基因组分析，从转化的细胞中分离出，通过AAV CAS9系统证实了肿瘤蛋白53和APC基因的有效基因编辑和帧移位。

此外，转化的舌细胞在野生C57黑色六只小鼠中有效形成肿瘤。对肿瘤细胞的免疫体化学分析揭示了E-Cadherin和Keratin14的细胞质表达，这两种是上皮组织标记。尝试此程序时，请始终记住，太多的切碎或太多的酶反应会导致细胞的生存能力降低，从而降低病毒的事务效率。

使用这个程序，细胞系可以进行基因改造，从任何感兴趣的组织中获得癌细胞的致肿瘤和转移潜力的洞察。