A caracterização aprofundada dos VEs pode ser um desafio, exigindo vários instrumentos para descrever parâmetros individuais. Medir esses critérios-chave em uma única técnica como a Citometria de Nanofluxo descreve várias subpopulações de EVs simultaneamente. Assim, cada EV é medido individualmente identificando partículas maiores que 14 nanômetros de diâmetro livres de rótulo antes de determinar sua fluorescência.
Isso cria um conjunto de dados robusto, removendo falsos positivos. A Citometria de Nanofluxo pode ser aplicada a EVs de uma variedade de fontes, incluindo aquelas enriquecidas a partir de plasma, LCR e meio de cultura. Esta técnica também é usada para a análise de vírus, nanopartículas lipídicas e nanomateriais.
É importante otimizar o protocolo de rotulagem. Isso maximiza qualquer fluorescência associada a uma partícula em comparação com qualquer fluorescência residual deixada no buffer. Para começar, ligue o instrumento, carregue o Nano-Flow Profession e selecione Start Up no menu suspenso Sheath Flow, carregue água no compartimento de carregamento e selecione Boosting no menu suspenso Sheath Flow.
Dilua os grânulos QC de um a 100 em água destilada em um tubo de 0,6 microlitros e coloque-o no compartimento de carga para introduzir a amostra no sistema. Em seguida, aumente a amostra por 45 segundos, conforme demonstrado anteriormente, para substituir completamente a amostra, a água ou a solução de limpeza anteriores. Durante o impulso, defina a potência do laser para o modelo predefinido para contas QC para o padrão FL QC de 250 nanômetros.
Posteriormente, para reduzir a pressão do sistema, selecione a pressão de amostragem no mesmo menu suspenso e defina a pressão de amostragem automática para um quilo pascal para manter uma pressão constante. Em seguida, inicie a análise de um minuto selecionando Time To Record nos controles de aquisição. Os dados serão plotados no gráfico de pontos mostrando uma escala de log para intensidade de dispersão lateral e uma intensidade de fluorescência selecionada.
Antes de salvar o arquivo, insira o nome do arquivo e a diluição da amostra. Em seguida, selecione descarregar para remover o tubo do compartimento de carga. Substitua os grânulos QC por 150 microlitros de solução de limpeza e limpe por mais de 30 segundos selecionando Boosting.
Usando um tubo contendo 150 microlitros de água, remova qualquer solução de limpeza em excesso da ponta capilar mergulhando a ponta em água. Em seguida, dilua as contas padrão de tamanho de um a 100 em água e carregue 100 microlitros no compartimento de carga. Agora, defina a potência do laser para o modelo predefinido, S16 EXO 68 a 155 nanômetros.
Essa configuração é tanto para o padrão de tamanho quanto para amostras contendo EVs menores que 200 nanômetros. Seleccione a amostragem e proceda ao registo da amostra durante um minuto. Execute a terceira medição com uma amostra de água ou PBS para criar um desvalorizante de medição em branco, identificando falsos positivos para remoção pelo software.
Diluir as amostras de EV não marcadas em PBS para uma faixa de concentração de partículas adequada de uma vez 10 a oitava a cinco vezes 10 a oitava partículas por mililitro para análise nFCM. E carregar de 10 a 100 microlitros da amostra diluída no compartimento de carga. Se a concentração de partículas for desconhecida, comece com uma diluição de um a 100 da amostra EV.
A concentração da amostra pode ser rapidamente aproximada pelo tamanho do ponto laser na câmera CCD durante o aumento ou pela observação do traço de explosão do evento durante a amostragem. Depois que a amostra carregada for impulsionada por 45 segundos, grave por um minuto e salve o arquivo conforme demonstrado anteriormente. Após a gravação, comece a analisar esses dados, alternando da guia Aquisição para a guia Análise e abrindo os arquivos NFA salvos.
Para uma medição precisa da amostra, use as duas medições padrão feitas antes da medição por amostragem para definir valores para comparação de amostras, bem como o espaço em branco. Crie a curva padrão de tamanho para conversão de dispersão lateral em diâmetro selecionando o arquivo padrão de tamanho e usando a ferramenta de limite definido. O limiar, visível no traço de explosão do evento, identifica a intensidade mínima de sinal necessária para que um evento seja considerado significativo.
Com o limite definido, verifique os parâmetros do gráfico de pontos, SS-H ou SS-A no eixo X e FITC-A no eixo Y. Abra a ferramenta Geração de curva padrão e selecione S16 EXO 68 a 155 nanômetros como modelo de dimensionamento. Clique em Localizar picos para identificar as intensidades de dispersão lateral do pico como partículas de 68, 91, 113 ou 155 nanômetros de diâmetro.
Antes de fechar a janela, verifique se o lado espalhado para a curva de diâmetro foi gerado com um valor R próximo a um. Defina o padrão de concentração. Selecione o arquivo salvo, clique em contar padrão e insira a concentração de partículas do padrão.
Defina as informações padrão. Selecione o arquivo de exemplo EV e defina o limite. Selecione o arquivo em branco e clique em set blank para identificar o número de falsos positivos para remoção da contagem de amostras.
Uma vez que a Ferramenta de geração de PDF é aberta, verifique o tamanho, a concentração e as diluições da amostra. Em seguida, mostre a concentração da amostra e a distribuição de tamanho das partículas. Depois de rotular as amostras de EV conforme descrito no manuscrito, pegue um microlitro da amostra rotulada e dilua de um a 50 em PBS em um tubo de 0,6 mililitro.
Carregue a amostra no compartimento de carga e aplique pressão de aumento por 45 segundos. Além disso, certifique-se de que as configurações corretas do laser e as lentes apropriadas estejam carregadas. Agora, mude para a pressão de amostragem e selecione o tempo para gravar.
Após a aquisição de um minuto, nomeie o arquivo de dados e salve. Descarregue a amostra, substitua-a por uma solução de limpeza e aumente a solução de limpeza por mais de 30 segundos antes de carregar a próxima amostra rotulada, conforme demonstrado anteriormente. Para a geração de PDF, aplique os mesmos padrões demonstrados anteriormente.
Somente a medida em branco será definida de forma diferente. Selecione o arquivo de exemplo e defina o limite. Selecione a ferramenta de bloqueio e use o clique esquerdo para desenhar uma linha separando a população positiva de fluorescência.
Defina os nomes e as cores para representação. Defina o arquivo em branco e clique em definir em branco para identificar o número de falsos positivos para remoção de cada população diferente. Abra a Ferramenta de geração de PDF e identifique a distribuição de tamanho, a concentração e a porcentagem da subpopulação positiva para fluorescência.
No gráfico de pontos, altere o eixo Y para mostrar as medições de fluorescência do canal verde ou vermelho. Defina o espaço em branco e gere o PDF conforme demonstrado anteriormente. No gráfico de pontos, defina o eixo X como FITC e o eixo Y como APC.
Utilize a ferramenta de quadrante para identificar populações fluorescentes positivas duplas. Defina nomes e cores para serem representativos, abra o arquivo PDF e selecione as subpopulações fluorescentes. Os EVs derivados de C2C12 apresentaram aproximadamente 50%CD9, 30%CD63 e 70% da população apresentou pelo menos um dos três marcadores de EV.
Os perfis de tamanho para subpopulações de EV marcadas com tetraspanina única mostraram um tamanho mediano maior de aproximadamente 75 a 85 nanômetros e menos de 65 nanômetros EVs em comparação com a população total de partículas. Os EVs derivados de SW620 apresentaram aproximadamente 40%CD9, 7%CD63 de apresentação e 42% de partículas como tendo pelo menos um dos três marcadores. Os EVs derivados de SW620, marcados com tetraspanina, mostraram uma distribuição mais normal e maior diâmetro mediano entre 90 a 110 nanômetros com distribuições semelhantes entre subpopulações individuais positivas para tetraspanina.
A marcação por membrana mostrou repetidamente 80% de positividade dos EVs derivados de C2C12 e SW620. A intensidade de dispersão lateral correlacionou-se com a intensidade do FITC nos gráficos de pontos de C2C12 e SW620. As percentagens duplamente positivas são muito semelhantes às percentagens positivas da tetraspanina.
E a rotulagem CD63 parece mostrar a correlação mais fraca com a rotulagem por membrana. As medidas de positividade percentual foram semelhantes entre a marcação de anticorpos com e sem marcação de membrana adicional. A intensidade média de fluorescência para as populações fluorescentes de EVs derivados de C2C12 sugeriu uma apresentação mais baixa de CD63 e CD81 em comparação com os EVs CD9, enquanto SW620 mostrou que o uso de todos os três anticorpos fornece um sinal de fluorescência maior do que qualquer rótulo de anticorpos individual Neste protocolo, marcadores EV comuns foram marcados fluorescentemente, mas muitos dos alvos de anticorpos podem ser escolhidos para mostrar a origem do EV, a função EV, ou o estado da doença.
