用于黑腿蜱、肩突硬蜱基因编辑的胚胎注射技术

这是第一个针对Chelicerata物种的胚胎注射方案。注射蜱胚胎的能力将开辟许多研究领域，特别是对蜱基因功能和蜱病原体相互作用的研究。该技术允许将来进行蜱基因的功能研究，并为使用基因驱动系统控制蜱虫种群提供基础。

这种方法将有助于理解蜱虫与它们在分子水平上携带的病原体之间的相互作用。这将使我们能够识别可用于开发莱姆病和其他病原体疫苗的蛋白质。而蜱病原体相互作用和蜱虫在喂养过程中通过蜱传播给宿主的几个研究领域将从这项工作中受益。

更基本的问题，如蜱虫如何逃避宿主的免疫反应，以及DNA修复机制的差异，现在也可以理解。在执行此过程之前，需要了解蜱生物学的几个方面。胚胎的高内部压力在被针头触摸时会导致破裂。

准备注射胚胎非常重要。首先，将雌性从4摄氏度转移到27摄氏度的孵化器中，以便在注射前一周开始产卵。当雌性开始产卵三到四天后，用细尖画笔去除任何卵，同时为雌性准备吉恩的器官消融。

要清空腺体，请将妊娠蜱虫放在显微镜下的载玻片上，以使口器在腹侧和背侧都可见。然后小心地刺穿背侧口器后面的区域，并使用镊子在腹侧施加压力。放置无绒湿巾的边缘，去除从穿刺部位流出的液体蜡。

或者，可以在蜱口周围使用诸如组织粘合剂之类的胶水，而不是通过解剖来排空腺体。当雌性再次开始产卵时，用细画笔收集新鲜沉积的卵，并将它们放入1.5毫升微量离心管中。在含有0至18小时龄鸡蛋的管中加入约200微升5%苯扎氯铵水。

用画笔轻轻旋转鸡蛋五分钟，以避免鸡蛋沉淀在管底部，然后用微量移液管去除上清液，将鸡蛋留在管中。向装有鸡蛋的试管中加入约200微升蒸馏水。用画笔旋转，然后使用微量移液管从微量离心管中取出水。

用蒸馏水洗涤后，加入约200微升5%氯化钠，用画笔轻轻旋转五分钟。然后，五分钟后从管中取出溶液，并用蒸馏水清洗鸡蛋两次。接下来，在含有鸡蛋的微量离心管中加入约100微升1%氯化钠溶液。

首先，将两个玻璃显微镜载玻片粘合在一起，留出约0.5厘米的间隙以支撑使用双面胶带对齐鸡蛋，并在载玻片之间的间隙中的双面胶带上涂上一块透明薄膜敷料。然后使用画笔在幻灯片上一次对齐 8 到 10 个鸡蛋。然后将带有对齐鸡蛋的载玻片放在复合显微镜的载物台上，并使用存放它们的无绒湿巾去除 1% 氯化钠溶液。

将填充的注射针连接到连接到微型机械手的微型注射器上。接下来，使用微型注射器上的高压设置将其轻轻摩擦在鸡蛋表面上，从而打开针头。打开针头后，根据针头的开口降低微型注射器的压力。

然后尽快以10至15度角将所有鸡蛋注射到载玻片上，快速踩下脚踏板，并立即用湿纸巾将载玻片移动到培养皿中的高湿度条件下。将含有注射胚胎的载玻片放入衬有湿滤纸的大培养皿中五到六个小时后，将一小滴蒸馏水加入附有注射胚胎的透明薄膜敷料中。然后，用画笔轻轻地置换鸡蛋。

接下来，将鸡蛋转移到一个小培养皿中，并将它们浸入蒸馏水中。将鸡蛋浸没在水中，将培养皿放入6夸脱塑料盒中，在27摄氏度的培养箱中，相对湿度超过90%。当幼虫在注射后21至25天开始从注射的胚胎中孵化时，每天检查它们，并将任何孵化的幼虫转移到顶部有屏幕的玻璃小瓶中。

结果表明，在胚胎发生早期12至18小时注射卵子，并将卵子的较长轴垂直于载玻片边缘对齐，导致注射卵子的存活率更高。在所有注射的卵中，高达8.5%存活并孵化幼虫。在开始此过程之前，重要的是要记住步骤2.4，从母蜱中去除蜡，以及步骤3.1至3.4，用苯扎氯铵软化胚胎的绒毛膜，并用氯化钠溶液干燥胚胎以使胚胎注射成功。

这种方法主要用于蜱基因编辑，这将使我们能够进行敲除和敲入，这将有助于我们了解蜱基因功能。该技术将允许使用可用于许多其他生物体的基因编辑工具应用于蜱虫研究。这将加速蜱虫分子生物学研究。