胚胎注射用于CRISPR介导的诱变在蚂蚁Harpegnathos盐化剂中

该协议使我们能够生成转基因蚂蚁，以了解基因在社会环境中的交流和行为中的功能。操纵真社会昆虫的遗传系统具有挑战性，因为许多物种不会在实验室环境中交配和繁殖。蚂蚁高鼻细胞底中引人注目的表型可塑性使我们能够建立CRISPR介导的突变系。

演示该程序的将是来自实验室的研究生Kayli Sieber。在22至25摄氏度的蚂蚁饲养室的透明塑料盒中保持野生型H.saltator菌落，并有12小时的光照，12小时的黑暗照明时间表。使用小箱子饲养单个工蜂或小菌落，使用中型或大型箱子饲养较大的菌落。

要创建巢箱，请使用石膏制作地板。当湿石膏在介质和大盒子中干燥时，将泡沫块压入石膏中，深度为几厘米，距离盒子背面几厘米，以指定较低的巢穴区域。石膏干燥后，用一块方形玻璃覆盖指定的巢穴区域。

每周两次用活蟋蟀喂食菌落，并用洗手瓶定期将水浇在塑料巢箱地板上。每当喂食时，清除垃圾和死人。将所有废物和死蚂蚁在零下30摄氏度下冷冻过夜，然后再将这些材料作为普通垃圾处理。

定期向蜂群添加一小撮干锯末，以帮助幼虫化蛹并帮助工人保持巢箱清洁。使用微量移液器拉拔玻璃显微注射针。确保所使用的玻璃已存放在无尘和清洁的环境中。

使用两步过程拉显微注射针。第一步，将热量设置为 575，将灯丝设置为 3，将速度设置为 35，将延迟设置为 145，将拉力设置为 75。对于第二步，将热量设置为 425，将灯丝设置为 0，将速度设置为 15，将延迟设置为 128，将拉力设置为 200。

确保所得针具有 2 毫米的锥度和 0.5 微米的尖端。拔针后，请将其保存在无尘和清洁的环境中，直到使用。制备酪蛋白和体外合成的小向导RNA的显微注射混合物。

将混合物放在冰上，直到需要装入显微注射针头。不使用时，将显微注射混合物储存在零下80摄氏度。将注射参数设置为注射压力为140百帕斯卡，恒压为70百帕斯卡，时间为0.4秒。

调整恒定压力，使材料仅沿一个方向流动，并且仅在没有材料从针头流入胚胎时才调整注射压力和时间。使用微量加载移液器吸头将显微注射针头装入两微升混合物。慢慢地这样做，以确保混合物中不会形成气泡。

沿胶带边缘仅折断针尖，以便仍保持窄锥度。确保针头断裂到足以打开尖端的程度，但不要太过严重，以至于锥度断裂。然后将针头安装到微型机械手上。

从合胞期选择胚胎进行显微注射，合胞期是细胞核分裂而没有细胞分裂的时候。将胚胎排列在粘在玻璃显微镜载玻片上的双面胶带板上，确保它们很好地固定在胶带上以防止注射过程中移动。将胚胎垂直放置，使每个胚胎的侧侧位于胶带的边缘。

将载玻片和衬里的胚胎放在指定的显微注射工作站的显微镜载物台上。使用显微操纵器将针头与要注射的第一个胚胎对齐，并在显微镜下沿其背侧或腹轴横向刺穿第一个胚胎。注射显微注射混合物，并寻找胚胎的轻微运动，表明由于注射的液体导致内部压力增加。

此外，注意胚胎外膜上含有可见组织或脂质痕迹的小液滴的形成。轻轻地从胚胎中取出针头，并通过调整显微镜载玻片的位置进行下一个胚胎。重复直到所有胚胎都被注射。

成功注射载玻片上的所有胚胎后，将载玻片转移到潮湿的盒子中一小时，让胚胎有时间恢复，然后再从载玻片中取出。孵育后，用乙醇洗涤载玻片，使用轻量级镊子从胶带中轻轻取出注射的胚胎，并将它们转移到装有少量70%乙醇的管中。将试管倒置几次。

使用小而柔软的画笔，将所有注射的胚胎转移到含有2%抗生素抗真菌剂的1%琼脂平板上。将板在25摄氏度下孵育约四周，定期检查孵化情况。一旦第一个胚胎孵化成幼虫，将所有胚胎和幼虫放回巢箱，由一些年轻的护士来照顾幼崽。

按照先前演示的方法维持菌落。该协议用于在Harpegnathos盐化胚胎中成功进行基因组编辑。通过PCR和pGEM克隆从注射胚胎中提取的DNA来验证结果，然后进行DNA测序。

使用该协议的体细胞诱变效率达到约40%F1突变雄性与野生型雌配以产生杂合F2雌性，如果不交配，则产生F3雄性。突变的F3雄性与杂合雌配以产生F4纯合突变雌性。由于成功的诱变，观察到与靶基因丢失相关的异常行为。

Orco的丧失与信息素感应丧失，无法检测猎物，繁殖力受损以及从殖民地徘徊有关。执行此方案时，需要尽量减少注射过程中的胚胎损伤。这可以通过确保针尖不会打开太宽以及在注射时缓慢移动针头来完成。

类似的技术可用于产生和维持转基因蚂蚁，这将为探测神经元活动和行为提供更复杂的工具。CRISPR介导的神经发生已被用于其他真社会昆虫物种，如蜜蜂，克隆掠夺蚁和火蚁。遗传修饰将促进真社会昆虫发育、生理和社会行为的功能研究。