东方果蝇背侧芽孢杆菌CRISPR/Cas9诱变实验方案

东方果蝇是一种高度入侵和适应性强的害虫。功能基因研究的有效方法可以帮助我们制定环境友好型害虫管理策略。这种方法效率高，成本低。

我们的协议将作为东方果蝇研究人员产生突变果蝇的有用指南。首先，预测感兴趣的靶基因的结构，并通过背侧芽孢杆菌基因组的生物信息学分析确定外显子和内含子之间的边界。使用市售的 gRNA 合成试剂盒生成设计的 sgRNA。

将gRNA产物重悬于无核酸酶的水中。使用紫外可见分光光度计定量浓度，并在使用前储存在80摄氏度。将背蛹放入塑料笼中，饲养条件为55%相对湿度，26.5摄氏度，光照/天周期为14：10。

当成虫闭合时，提供糖和酵母的混合物作为食物以及水。大多数成虫在出苗后10天达到性成熟。使用30至50勒克斯的灯架来提高雌性的繁殖力，从而提高胚胎收集的效率。

接下来，将一块 200 目纱布放在距离腔盖约 1 至 2 毫米的产卵室中。当显微注射装置准备就绪时，将新的产卵室放入笼中。使用细湿刷每10分钟收集一次胚胎，并将它们排列在自制的注射板上。

注射过程中将胚胎浸入卤烃油中，以避免进一步干燥。通过将Cas9蛋白和相应的sgRNA混合至每微升300纳克的浓度来制备工作溶液。然后，在混合物中加入 1 微升酚红，作为标记注射胚胎的便捷方法。

将制备好的混合物放在冰上以避免sgRNA降解。使用微量移液器拉拔器准备玻璃注射针。将3微升混合物加入注射针中，不要引入气泡。

然后，使用微量研磨机打开针头，并根据用户指南将其连接到显微操纵器。将注射器的参数设置为 Pi 为 500 百帕斯卡。Ti到0.5秒，PC到200百帕斯卡。

将带有排列胚胎的板放在物镜桌上。然后，在精细光学显微镜下调整微量移液器位置，将微量移液器和胚胎设置在同一平面上。将针尖插入胚胎的后部或植物极。

然后，从注射器踩下踏板，将混合物输送到胚胎中。轻微红色的出现是由于混合物中添加了酚红。将装有注射胚胎的注射板放入人工气候室中。

36小时后，使用细尖刷将孵化的幼虫转移到幼虫饮食中。每天收集幼虫三到四次，直到不再有幼虫孵化。接下来，将成熟的幼虫放入湿沙中化蛹。

化蛹阶段需要10天。化蛹后，在闭合开始之前将蛹移到塑料笼中。从新鲜的蛹或单个成虫的单个中腿中分离基因组DNA并设计特定的引物以扩增靶区后，按照文本手稿中描述的循环条件进行聚合酶链反应或PCR。

然后，对纯化的PCR产物进行测序。检测靶位点附近的多个重叠峰提示诱变成功。对于亚克隆，将纯化的PCR产物与平端载体混合，并在25摄氏度下连接它们15分钟。

然后，加入反式T1细胞并将其放在冰上30分钟。然后，加入 500 微升 LB 培养基，并在 37 摄氏度下振荡孵育 1 小时。离心并弃去上清液。

重悬沉淀并将其铺在LB板上。将板置于 37 摄氏度下孵育过夜。然后，选择单个细菌菌落进行测序以验证突变体的基因型。

在这项研究中，所选基因的靶位点的例子位于第三个外显子中。靶位点高度保守，通过凝胶电泳检测合成gRNA和体外转录gRNA的DNA模板的单条带。此处显示了显微注射后的背侧双歧杆菌存活和诱变。

对PCR产物进行测序后，80%的G0个体是镶嵌突变体。在突变体筛选中，具有8个碱基对缺失的突变体导致氨基酸翻译过早终止。将针头插入胚胎的后部区域或植物极是一个核心步骤，因为这直接影响卵子的存活。

该技术为研究背苜蓿基因功能领域提供了参考，它们可以通过这种方法快速捕获自己想要的突变体。