造血干细胞和祖细胞的CRISPR/Cas9基因编辑用于基因治疗应用

离体培养会阻碍造血干细胞和祖细胞的再增殖潜力。我们的方案在培养过程中保留了干性，从而提高了体内基因修饰细胞的频率。造血干细胞基因疗法目前正用于单基因疾病和艾滋病毒等传染病。

HSPC基因治疗方案严重依赖离体培养。我们的方案应与任何采用离体培养的程序兼容。演示该协议的将是我实验室的博士生Vigneshwaran Venkatesan。

分离HSPC后，在含有细胞因子和小分子白藜芦醇，UM729和StemRegenin1的干细胞培养基中培养它们。在基因编辑之前，将温度混合器设置为37摄氏度以重建引导RNA，然后将TE缓冲液预热至37摄氏度10分钟。将合成的化学修饰的sgRNA小瓶以11， 000倍g在4摄氏度下离心1分钟，并向含有1.5纳摩尔冻干sgRNA的小瓶中加入15微升TE缓冲液，并通过轻轻旋转混合以获得每微升100皮摩尔的最终浓度。

将小瓶在热混合器中以37摄氏度的最小摇动孵育30至40秒。轻轻敲击侧面的小瓶并旋转小瓶以收集 15 微升 sgRNA。制作 1 微升等分试样，并在零下 80 摄氏度下储存长达 1 年。

对于核转染，通过在室温下以200倍g离心5分钟，将沉淀2乘10至第5个细胞。弃去上清液后，将沉淀重悬于20微升缓冲液中。将细胞悬液与制备的RNP复合物轻轻混合，避免气泡。

现在，将悬浮液转移到商业核连接条上，并通过选择脉冲代码DZ-100使用4D-核电孔器电穿孔细胞。向核转条中的电穿孔细胞中，加入100微升预孵育培养基，并使细胞在室温下不受干扰10分钟。在孵育结束时，按照实验要求将内容物转移到培养板中。

在HSPC移植前6至8小时内将NSG小鼠放入馅饼笼中。使用市售辐照器以3.5灰度照射小鼠。对于NBSGW，在HSPC移植前48小时腹膜内注射白消安，以每公斤体重12.5毫克的剂量预先调节6至8周龄的雄性和雌性小鼠。

为了输注1只小鼠，通过在1.5毫升管中以200倍g离心5分钟，将6乘以10至第5个细胞沉淀。在室温下。轻轻移出上清液而不干扰沉淀，并将细胞沉淀重悬于100微升PBS中。

将预先调节的NSG或NBSGW小鼠放入小鼠约束器中，并通过尾静脉注射输注HSPC。握住鼠标尾巴并轻轻推动插头以约束鼠标。用70%乙醇轻轻擦拭小鼠尾巴。

使用31号胰岛素注射器，吸出100微升细胞悬液。现在，将红外灯的光引导到尾巴上 30 到 40 秒，用薄纸的褶皱覆盖小鼠的身体区域。要用注射器将尾巴保持在刨轴上，请用左手食指提起它。

以20度角轻轻地将针的斜面部分插入左尾静脉或右尾尾静脉。推动柱塞将细胞悬液注入静脉，并用薄纸在穿孔区域附近施加轻微的压力，然后拔出针头。麻醉后，将动物置于腹侧卧位，轻轻揉搓小鼠睁开眼睛，让眼睛的眼球略微突出。

以 30 至 45 度角轻轻地将牧草移液管插入眼内眦膜下方。将巴斯德移液器置于适当位置后，对管施加轻微压力并开始轻轻旋转管。收集 50 至 80 微升外周血后，轻轻地将移液器从眼睛的内眦抽出。

安乐死后，在尿道上方 1 厘米处做一个垂直切口，并延伸到横膈膜下方 1 厘米处。在切口区域的角落水平切割以打开腹部区域。解剖股骨和胫骨后，用剪刀去除附着在股骨和胫骨上的软组织，并用薄纸轻轻擦洗骨骼。

用手术刀在0.5毫升微量离心管底部开一个直径不超过0.2厘米的小孔。使用手术刀取出骨头的近端，并将骨头切面朝向 0.5 毫升微量离心管的孔。现在，将装有骨头的 0.5 毫升管放入含有 100 微升无菌 PBS 的 1.5 毫升管中。

关闭盖子，在室温无菌条件下以200倍g旋转试管3分钟，并丢弃含有空骨髓腔的骨的0.5毫升管。向含有骨髓的1.5毫升反应管中，加入1毫升PBS，然后使用1毫升移液管，轻轻重悬细胞10次。将1毫升细胞悬液转移到含有9毫升红细胞裂解缓冲液的15毫升管中。

每两分钟轻轻倒置试管，将细胞在冰中孵育7分钟。孵育后，在室温下以200倍g离心管5分钟，然后重复洗涤，直到观察到透明的淡白色沉淀。在核转染48小时后，RUS组中活细胞和CD34阳性，CD90阳性细胞的频率增加。

72小时后，与DMSO治疗组相比，RUS治疗组的插入缺失的百分比和频率增加，表明基因编辑增加。CD34阳性，CD90阳性细胞和总有核细胞的绝对数量在编辑后48小时显着更高。NSG小鼠中人CD45阳性细胞的流式细胞术分析显示，在培养条件下植入增加。

对小鼠BM细胞中基因编辑频率的分析显示，在补充RUS的培养条件下，基因编辑的HSPC的植入增加。以每毫升200， 000个细胞的汇合度培养HSPCs对于改善功能性干细胞至关重要。扩增脐带血干细胞和iSPC来源的干细胞是测试该协议的新领域。