基于CRISPR/Cas9技术构建迁徙蝗虫纯合突变体

迁徙蝗虫是一项重要的农业考验。该方法为CRISPR/CAS9构建纯合蝗突变体的系统化、详细的方法，包括取卵、突变体筛选和纯合子维持，提供了一种高效且易于产量的实验方案。首先，通过用微型移液器拉动玻璃毛细管来准备注射针。

按照文本手稿中的说明设置参数，然后用微型研磨机研磨注射针尖。通过将一微升Cas9蛋白与一微升经过验证的单向导RNA混合来制备用于注射的核糖核蛋白。然后加入八微升RNA的游离无菌水，使混合物的最终体积为10微升。

将溶液彻底混合并放在冰上。接下来，从卵位豆荚中收集新鲜产下的蛋荚，等待蛋鞣。30分钟后，用细刷将鸡蛋与鸡蛋荚中的水隔离开来，并用无菌水清洗鸡蛋三次。

然后将鸡蛋放入培养皿中，加入无菌水以保持湿润。用准备好的核糖核蛋白溶液填充注射针，并将注射液加载到显微机械手中。将显微注射参数设置为300百帕斯卡的注射压力，0.5秒的注射时间和25百帕斯卡的补偿压力。

设置参数后，踩下踏板以评估注入溶液的体积。调整注射压力和注射时间，确保注射量约为50至100纳升。将无菌卵子定期排列在注射垫上后，将垫放在显微镜的物体台上并调整显微镜的放大倍数，直到观察到卵子。

然后在显微镜下调整显微注射针，直到可以看到注射尖端，并将尖端放置在要注射的鸡蛋附近。以合适的高度和30至45度的角度开始注射。将尖端插入鸡蛋微堆附近的鸡蛋中，然后踩下踏板完成注射。

接下来，快速缩回针头并移动注射垫以注射下一个鸡蛋。将注射的卵子转移到带有湿滤纸的培养皿中。将它们放入 30 摄氏度的培养箱中。

注射后，每天检查注射卵子的发育情况。在前五天内每24小时将注射的卵子转移到新的培养皿中。在注射后的第六天，随机挑选并将 10 个鸡蛋转移到管中，并使用研磨机用两个钢球以 60 赫兹充分研磨鸡蛋六分钟。

研磨后，将碎屑重悬于一毫升PBS中。然后将5微升重悬的混合物转移到45微升50毫摩尔氢氧化钠中，在95摄氏度下裂解5分钟。要终止碱性裂解反应，向裂解系统中加入五微升一摩尔盐酸Tris溶液。

取1微升裂解产物作为PCR模板，扩增靶基因片段。PCR和测序后，将测序结果与野生型序列进行比较，以评估CRISPR/Cas9系统是否在体内切割了靶基因。允许其余的卵子进行后续发育，因为在胚胎阶段检测到插入缺失。

发育、转移和培养后，孵化的若虫进入手稿中所述的养殖网箱。当若虫发育到第五龄期时，用塑料培养杯将它们分开。使用G0突变体和野生型蝗虫进行杂交育种。

收集绿洲后，在每个绿洲中使用三到六个发育的卵来检测前面描述的突变。保留突变阳性辅助剂以供后续发展，放弃突变阴性辅助剂。为了冷冻保存，用无菌水清洗鸡蛋，并如前所述将它们在培养皿中孵化。

五到六天后，将鸡蛋聚集在培养皿中，并用滤纸碎片覆盖它们。然后用石蜡膜包裹整个培养皿。将盘子放在 25 摄氏度下两天，然后在 13 至 16 摄氏度的较低温度下再放置两天。

然后将盘子转移到六摄氏度的冰箱中。每两周在盘子中加水，为鸡蛋提供潮湿的环境。最后，为了复苏冷冻保存的卵子，将培养皿置于 25 摄氏度下两天。

之后，将卵放入 30 摄氏度的孵化器中，直到若虫孵化。在这项研究中，CRISPR/Cas9系统的靶位点位于第一个外显子中。在Cas9切割试验中，CRISPR/Cas9核糖核蛋白可以消化含有靶位点的PCR片段，切割率约为55%。

编辑效率为52.73%的若虫孵化率，66.67%的G0成虫为马赛克突变体。突变系的传代策略如图所示。将多余的纯合子蛋冷冻保存，以提高纯合子的利用率。

虽然冷冻保存卵的孵化率随着冷冻保存时间的延长而降低，但施用滤纸碎片和在温度上升梯度下回收这些皮蛋等补救措施有助于复苏。最重要的是尽量限制显微注射造成的机械损伤。该程序可用作获得其他昆虫的参考。

一些细节的一部分，如鸡蛋收集、注射和作物的方法，应该修改。该技术也有助于研究昆虫的和环境适应以及纯合蝗突变体的构建，加速该领域的研究。