CRISPR-Cas9介导的斑马鱼心脏中的精确敲入编辑

我们的协议为CRISPR编辑的精确整合和简单的视觉检测提供了一个管道，以及编辑后表型的一个例子。这种方法的主要优点是易于CRISPR编辑检测，允许有效和简化地识别成功的编辑。这种方法允许简单地生成和表征斑马鱼中与疾病相关的变异。

在这里，我们正在研究长QT综合征。然后可以探索药物疗法的后续研究。首先设计两个 sgRNA 向导，通过鉴定目的基因的斑马鱼直系同源物来切除敲入靶位点序列。

使用 Ensembl 在感兴趣的基因序列中定位目标位点，包括用于制作模板的两千碱基侧翼序列。使用CRISPOR等设计软件工具，选择Danio rerio物种和Cas酶。对于两种 sgRNA 方法，在靶外显子之前选择一个 sgRNA，在紧邻下游内含子内选择第二个 sgRNA。

确保所选的sgRNA具有高特异性和低预测脱靶结合。使用CRISPOR排名来识别具有最小脱靶结合的指南。现在确定基于PCR的Sanger测序基因分型最有可能的潜在脱靶位点。

选择两个sgRNA后，获得每个sgRNA的反向补体，突变前的两个互补寡核苷酸和突变下游的两个互补寡核苷酸。在每个寡核苷酸上添加兼容的限制性内切位点，以将指南掺入所选质粒中。为了将选定的引导序列整合到DR274质粒中，使用五个主要的BSA1限制性位点创建一个突出部分，并在指南的五个主要末端设计BSA1识别位点。

接下来，通过选择两个序列片段来设计斑马鱼中HDR的外源模板，这两个序列片段将位于PKHR5质粒中的M静脉YFP报告基因的侧翼。将模板分成两段，将其插入M静脉YFP报告基因的两侧。确保拆分位点处于内含子中，以避免切断编码序列。

结合稿件中提到的所有必需的修改，以促进克隆到PKHR5质粒中。在受精后约40分钟将胚胎注射到一个细胞阶段。受精三天后，将斑马鱼幼虫转移到含有0.3%MS222的25毫米培养皿中麻醉斑马鱼幼虫，直到它们失去自扶正反射。

麻醉后，将幼虫转移到24孔板的孔中。使用能够检测GFP或YFP的显微镜，在幼虫的眼睛中筛选报告基因荧光。捕获幼虫的图像后，记录报告基因表达的存在与否。

为了确认准确和精确的HDR基因编辑，如前所述，在受精后三天首先麻醉幼虫，并使用热射方法从尾夹中分离基因组DNA，从而进行基因分型。将切除的尾夹加入 15 微升 25 毫摩尔氢氧化钠中，并在 95 摄氏度下孵育 20 分钟，然后用 1.5 微升三盐酸中和。以13， 800倍G离心30秒，并保留含有提取的基因组DNA的上清液。

回收E3培养基中的幼虫，如果打算进一步研究，将其返回住房系统。使用提取的基因组DNA作为模板，对靶向和潜在的脱靶位点进行基于PCR的Sanger测序。确保靶向引物设计捕获突变位点和最近的sgRNA结合位点。

设计单独的测序引物来检测插入的同源臂和靶基因的过渡，以确认整合到目的基因中。设计引物以对前三个潜在的脱靶位点进行测序。编译每条斑马鱼可识别的靶上和脱靶基因分型、心率、心包尺寸、心电图表型和报告基因数据。

在岛屿中观察到YFP M静脉报告基因表达，作为成功模板整合的阳性报告基因。发现报告基因阳性的鱼具有精确的编辑G2A，它将R56Q变体引入ZKCNH6A。此处显示了心包尺寸与眼部面积之比的测量。

在R56Q基因编辑的幼虫中观察到与斑马鱼心脏复极化障碍相关的心包水肿增加的心动过缓趋势。此处显示了受精后三天斑马鱼幼虫心脏的心电图记录。这种方法最重要的方面是引导设计，这在CRISPR程序中经常出现。

有效的指南对于成功的CRISPR编辑至关重要。可以遵循替代的CRISPR方法，以实现更高的精度或其他功能。此外，可以插入大基因，例如提供体内诱导编辑系统的素编辑复合物。