基于声流体微器件的细胞和细胞核可压缩性测量

细胞力学在肿瘤转移、细胞恶性转化和放射敏感性中起重要作用。声流体法可以在悬浮状态下实现快速无损的测量。该技术可用于反映上皮向间充质转化过程中自压缩性的变化和分离循环肿瘤细胞，显示出其在癌症诊断中的应用前景。

首先，用直径为一毫米的空心针在入口和出口的PDMS块上打孔，将PDMS块与芯片绑定。然后将PDMS块和芯片背面朝上放入等离子清洁器中一分钟。将PDMS模块上的孔与芯片入口和出口对齐后，将PDMS模块轻轻按压芯片15秒，导致PDMS模块与芯片表面之间发生粘合。

要将PTFE导管连接到芯片，请切割两根内径为0.8毫米，长度为10厘米的导管。将内径为0.7毫米，长度为1.5厘米乘90度的不锈钢针弯曲成L形，并将其连接到导管的一端。将不锈钢针插入PDMS块的孔中。

对于入口，将 19 号分配针连接到导管的另一端，作为注射器的连接器。之后，注入去离子水以测试整个通道的密封性。对于压电陶瓷组件，请选择宽度为 5 毫米的预切压电陶瓷片。

然后在压电陶瓷的一端焊接焊丝。通过在压电陶瓷上滴一滴氰基丙烯酸酯胶水，将压电陶瓷粘在芯片背面的中间。用牙签擦平胶水并去除多余的胶水。

然后快速将其按在芯片上并继续按压约一分钟。要安装微型设备，请切割一块PDMS作为微型设备的底座，并使用双面胶带将底座的一侧粘在入口和出口PDMS块上，另一侧粘在透明载玻片上。将整个微器件固定在显微镜载物台上，以将芯片保持在一个焦平面上。

为了制备聚苯乙烯标准颗粒溶液，将0.05毫升聚苯乙烯颗粒溶液加入到10毫升PBS中并充分混合。然后通过用PBS以90%汇合度洗涤贴壁细胞来制备细胞悬液。加入500微升0.25胰蛋白酶在室温下一至两分钟。

去除胰蛋白酶后，加入一毫升完全培养基并通过移液形成细胞悬液。接下来将细胞悬液以100G离心五分钟。除去上清液并重悬于0.5至1毫升PBS中以获得细胞悬液。

然后用血细胞计数器计数细胞，浓度约为每毫升300至500，000个细胞。如前所述制备细胞核悬液后，除去上清液，每20微升细胞调色板加入200微升细胞质蛋白提取试剂A并充分混合。然后将上述混合物以220G涡旋5秒钟，然后置于冰浴中10分钟。

接下来，在孵育后的溶液中加入10微升细胞质蛋白提取试剂B。涡旋后，置于冰浴上一分钟，然后再次以 220 G 涡旋五秒钟。然后，最后在 1000 G 下在 4 摄氏度下离心五分钟。

除去上清液并将调色板重悬于一毫升PBS中。然后在 1000 G 的温度下以 4 摄氏度离心四分钟。除去上清液后，重悬于100微升PBS中作为细胞核悬浮液。

将台盼蓝加入上述细胞核悬浮液中，并在室温下染色四分钟。接下来，用10倍物镜计算倒置显微镜下的细胞核数量。用PBS缓冲液稀释上述细胞核悬浮液至每毫升200至300， 000个细胞核的浓度。

然后通过70微米筛过滤细胞核悬浮液。要设置测量系统，请打开显微镜的光源并打开相机软件。使用4x物镜找到微通道的中间位置，即压电陶瓷的位置。

连接导线后，分别将它们焊接到压电陶瓷信号发生器输出的正极和负极。然后将注射器放在显微注射泵上并将其连接到入口导管。要从微通道收集液体，请在出口导管的末端放置一个小容器。

要确定测量参数，请用注射器吸出聚苯乙烯颗粒溶液。然后将溶液注入芯片微通道，同时避免气泡和芯片微通道，以确保准确测量。将信号发生器的输出设置为频率为 1 兆赫兹、峰峰值电压为 10 伏的符号信号，直到观察到粒子向微通道的中线移动，并在到达中线后沿中线保持向前运动。

将一毫升细胞或细胞核悬浮液与标准颗粒溶液以一比一的比例混合后，用注射器将其注入微通道以测量细胞和细胞核。当细胞或细胞核进入视野并打开信号发生器时，开始使用CCD相机进行记录。然后依次用去离子水、75%酒精和去离子水冲洗微通道，以备后用。

在不同时间间隔的声场力作用下，观察细胞和颗粒向微通道中线移动。对能量、密度和单元压缩性进行了计算，并从最佳拟合结果中获得了粒子的声能密度和实测运动轨迹。从细胞中分离出高纯度和完整的细胞核，并通过获取细胞核的运动轨迹进行细胞核压缩性测量。

测量并比较了不同类型癌细胞和不同剂量药物诱导的EMT或X射线照射后的细胞的压缩性。收集测量的细胞，发现培养48小时后与未处理组相比，细胞增殖和活力没有显着差异。表明压缩率测量对细胞增殖和存活没有影响。

最重要的是微调信号的频率，直到观察到粒子向微通道的中线移动。