La meccanica cellulare svolge un ruolo importante nelle metastasi tumorali, nella trasformazione maligna delle cellule e nella radiosensibilità. Il metodo acustofluidico può realizzare misure rapide e non distruttive in stati sospesi. Questa tecnica può essere utilizzata per rispecchiare il cambiamento di autocomprimibilità durante la transizione epiteliale-mesenchimale e separare le cellule tumorali circolanti, mostrando le sue prospettive di applicazione nella diagnosi del cancro.
Per iniziare, legare il blocco PDMS al chip perforando i fori nel blocco PDMS per le porte di ingresso e uscita con un ago cavo di un millimetro di diametro. Quindi mettere i blocchi PDMS e il chip con il retro in un pulitore al plasma per un minuto. Dopo aver allineato i fori sui blocchi PDMS con l'ingresso e l'uscita del chip, premere delicatamente i blocchi PDMS sul chip per 15 secondi, con conseguente incollaggio tra i blocchi PDMS e la superficie del chip.
Per collegare il catetere in PTFE al chip, tagliare due pezzi di catetere con un diametro interno di 0,8 millimetri e una lunghezza di 10 centimetri. Piegare un ago in acciaio inossidabile con un diametro interno di 0,7 millimetri e una lunghezza di 1,5 centimetri per 90 gradi in una forma a L e collegarlo a un'estremità del catetere. Inserire gli aghi in acciaio inossidabile nei fori dei blocchi PDMS.
Per l'ingresso, collegare un ago di erogazione da 19 gauge all'altra estremità del catetere come connettore per una siringa. Successivamente, iniettare acqua deionizzata per testare la tenuta del canale complessivo. Per un assemblaggio ceramico piezoelettrico, selezionare fogli di ceramica piezoelettrica pretagliati con una larghezza di cinque millimetri.
Quindi saldare i fili su entrambi i lati della ceramica piezoelettrica a un'estremità. Incollare la ceramica piezoelettrica al centro del retro del chip posizionando una goccia di colla cianoacrilica sulla ceramica piezoelettrica. Lisciare la colla con lo stuzzicadenti e rimuovere la colla in eccesso.
Quindi premerlo rapidamente sul chip e continuare a premere per circa un minuto. Per montare il micro dispositivo, tagliare un pezzo di PDMS come base del micro dispositivo e attaccare un lato della base ai blocchi PDMS di ingresso e uscita e l'altro lato a un vetrino trasparente usando del nastro biadesivo. Fissare l'intero microdispositivo allo stadio del microscopio per mantenere il chip su un piano focale.
Per preparare le soluzioni di particelle standard di polistirene aggiungere 0,05 millilitri di soluzione di particelle di polistirene a 10 millilitri di PBS e mescolare bene. Quindi preparare le sospensioni cellulari lavando le cellule aderenti al 90% di confluenza con PBS. Aggiungere 500 microlitri di 0,25 Tripsina per uno o due minuti a temperatura ambiente.
Dopo aver rimosso la tripsina, aggiungere un millilitro di mezzo completo e formare una sospensione cellulare mediante pipettaggio. Quindi centrifugare la sospensione cellulare a 100 G per cinque minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere in 0,5 a un millilitro di PBS per ottenere una sospensione cellulare.
Quindi le cellule sono state contate con un emocitometro e la concentrazione era di circa 300-500.000 cellule per millilitro. Dopo aver preparato la sospensione del nucleo cellulare come dimostrato in precedenza, rimuovere il surnatante e aggiungere 200 microlitri di reagente di estrazione proteica citoplasmatica A per 20 microlitri di palette cellulari e mescolare bene. Quindi vortice la miscela di cui sopra a 220 G per cinque secondi e mettere in bagno ghiacciato per 10 minuti.
Quindi, aggiungere 10 microlitri di reagente di estrazione della proteina citoplasmatica B alla soluzione dopo l'incubazione. Dopo il vortice, mettere in bagno ghiacciato per un minuto e vortice di nuovo a 220 G per cinque secondi. Quindi, infine centrifugare a 1000 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Rimuovere il surnatante e risospendere la tavolozza in un millilitro di PBS. Quindi centrifugare a 1000 G a quattro gradi Celsius per quattro minuti. Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere in 100 microlitri di PBS come sospensione del nucleo cellulare.
Aggiungere il blu di tripano alla sospensione del nucleo cellulare sopra e colorare a temperatura ambiente per quattro minuti. Quindi, conta il numero di nuclei al microscopio invertito con un obiettivo 10x. Diluire la sospensione del nucleo cellulare sopra con tampone PBS ad una concentrazione da 200 a 300.000 nuclei per millilitro.
Quindi filtrare la sospensione del nucleo cellulare attraverso un setaccio da 70 micrometri. Per impostare il sistema di misurazione, accendere la sorgente luminosa del microscopio e aprire il software della fotocamera. Usa l'obiettivo 4x per trovare la posizione centrale del microcanale, cioè la posizione della ceramica piezoelettrica.
Dopo aver collegato i fili, saldarli rispettivamente ai terminali positivi e negativi dell'uscita del generatore di segnale della ceramica piezoelettrica. Quindi posizionare la siringa sulla pompa di microiniezione e collegarla al catetere di ingresso. Per raccogliere il fluido dal microcanale, posizionare un piccolo contenitore all'estremità del catetere di uscita.
Per determinare i parametri di misurazione, aspirare la soluzione di particelle di polistirene con la siringa. Quindi iniettare la soluzione nel microcanale del chip evitando bolle d'aria e nel microcanale del chip per garantire una misurazione accurata. Impostare l'uscita del generatore di segnale su un segnale segnaletica con una frequenza di un megahertz e una tensione picco-picco di 10 volt fino a quando non si osserva che le particelle si muovono verso la linea mediana del microcanale e rimangono in movimento in avanti lungo la linea mediana dopo aver raggiunto la linea mediana.
Dopo aver miscelato una cellula millilitro o una sospensione di nucleo con la soluzione di particelle standard nel rapporto di uno a uno, iniettarla nel microcanale con una siringa per misurare cellule e nuclei. Avviare la registrazione con la telecamera CCD quando le cellule o i nuclei entrano nel campo visivo e accendono il generatore di segnale. Quindi sciacquare il microcanale con acqua deionizzata, alcool al 75% e acqua deionizzata in sequenza per un uso successivo.
Il movimento delle cellule e delle particelle è stato osservato sotto l'azione della forza del campo acustico verso la linea mediana del microcanale a diversi intervalli di tempo. Sono stati eseguiti i calcoli di energia, densità e comprimibilità della cella e la densità di energia acustica e la traiettoria di movimento misurata per la particella sono state ottenute dal miglior risultato di adattamento. L'elevata purezza e i nuclei intatti sono stati isolati dalle cellule e la misurazione della comprimibilità del nucleo è stata ottenuta ottenendo la traiettoria di movimento del nucleo.
È stata misurata e confrontata la comprimibilità di diversi tipi di cellule tumorali e cellule dopo EMT indotta da farmaci o irradiazione a raggi X con dosi diverse. Le cellule misurate sono state raccolte e si è scoperto che non vi era alcuna differenza significativa nella proliferazione cellulare e nella vitalità rispetto al gruppo non trattato dopo 48 ore di coltura. Indica che la misurazione della comprimibilità non ha alcun effetto sulla proliferazione e sulla sopravvivenza cellulare.
La cosa più importante è regolare la frequenza del segnale fino a quando non si osserva che le particelle si muovono verso la linea mediana del microcanale.
