使用肽-泊洛沙明纳米颗粒在培养细胞中高效转染 体外 转录的mRNA

肽-泊洛沙胺纳米颗粒是潜在的肺mRNA递送系统之一。我们的协议使肽-泊洛沙胺纳米颗粒具有更高的生产力和效率，这有助于粘膜mRNA疫苗的开发。该技术所需的材料成本低，协议可以在短时间内完成。

肽-泊洛沙胺纳米颗粒具有介导高效mRNA转染的能力。肽-泊洛沙明纳米颗粒在人支气管上皮细胞中表现出成功的mRNA转染，这涉及粘膜COVID-19疫苗，肺癌治疗和囊性纤维化基因治疗的其他应用。我希望个人在开始进行实验之前，在相关领域以及协议和许多技术方面有一些基本知识。

合成甲基荧光素酶的开放阅读框并将其克隆到pUC57载体中后，使用BamHI和KpnI在37摄氏度下制备线性化DNA模板1小时。如手稿中所述，使用 T7 转录试剂盒和假尿苷制备 20 微升体积的反应物用于 mRNA 合成。充分混合成分并在 37 摄氏度下孵育三小时。

然后，通过在 65 摄氏度下加热 10 分钟来去除 50 微克未加帽 IVT mRNA 的二级结构。使用Cap 1加帽系统进行IVT mRNA加帽，并通过使用S-腺苷蛋氨酸和2'O-甲基转移酶在37摄氏度下修饰7-甲基鸟苷帽结构30至60分钟来制备Cap 1。用紫外可见分光光度计测量加帽IVT mRNA的浓度。

使用 RNA 标记物，分析含有 18% 甲醛的 1% 甲醛变性琼脂糖凝胶中加帽 IVT mRNA 的分子量。通过将T704溶解在无核酸酶水中，制备每毫升10毫克的泊洛沙明704储备溶液。通过在无核酸酶水中溶解肽来制备每毫升2毫克肽储备溶液。

将制备的溶液储存在4摄氏度。在冰上解冻IVT mRNA。在打开试管之前，将试管在室温下以300倍G离心三秒钟，并用无核酸酶的水稀释IVT mRNA溶液。

通过将T704溶液稀释至每微升8微克浓度，将合成肽溶液稀释至0.555微克/微升浓度，分别用无核酸酶水制备T704和合成肽混合物溶液。在进一步使用之前，将混合溶液在室温下孵育15分钟。将IVT mRNA溶液吸入一毫升注射器中，避免注射器尖端的气隙或气泡。

将注射器装入旋转块旁边的墨盒一侧。然后，用T704和合成肽混合物溶液填充一毫升注射器，并去除注射器尖端的任何气泡或气隙。将注射器放入泵的另一个入口，并将泵的总流量设置为每分钟4至10毫升。

将十毫升无RNase的锥形管收集混合的IVT mRNA / PP-sNp溶液在混合装置的流路末端。运行泵开始混合，确保正确输入参数。运行泵六秒钟后，从锥形管中收集IVT mRNA / PP-sNp样品。

转染前24小时将人支气管上皮细胞和树突状细胞系接种在96孔板中。在补充有10%热灭活胎牛血清和1%青霉素链霉素的培养基中培养细胞。除去生长培养基后，用每孔PBS0.2毫升洗涤铺板细胞。

向含有铺板细胞培养物的每个孔中加入170微升无血清培养基。然后，向每个孔中加入30微升含有0.4微克甲基荧光素酶mRNA的IVT mRNA / PP-sNp制剂。用IVT mRNA / PP-sNp制剂在37摄氏度的潮湿5%富含二氧化碳的气氛中孵育细胞4小时。

吸出转染培养基，加入0.2毫升新鲜培养基，补充有10%热灭活胎牛血清和1%青霉素链霉素。如前所述，将转染的细胞孵育24小时，并从每个孔中收集要检测的上清液。通过将PBS添加到腔肠素底物中来制备新鲜的测定溶液。

涡旋10秒钟彻底混合溶液。将50微升收集的上清液加入96孔板中。设置酶标仪的读数时间为1， 000毫秒，并手动或通过自动进样向每个孔中加入30微升腔肠嗪溶液。

将腔肠嗪溶液加入上清液后，立即单击开始以测量发光信号。分离并消化重组质粒以产生线性化的DNA模板。体外转录产生上加和封端的MetLuc mRNA。

与转染市售脂质转染试剂、裸萤光素酶mRNA、PBS或T7044合成肽、人支气管上皮细胞中的混合溶液、16 HBE和树突状细胞系DC2.4萤光素酶mRNA/PP-sNp的细胞相比，转染的萤光素酶表达明显高于LP。 保护 MetLuc mRNA 免受降解，并促进外源性荧光素酶 mRNA 的转染效率。请确保成功去除未加帽的Met-mRNA的合成结构。仔细计算并下载 Met-mRNA T704 和肽化合物，以制备和压实泊洛沙明纳米颗粒。

可以进行透射电子显微镜以观察肽-泊洛沙胺纳米颗粒的形态。该技术可帮助研究人员开发粘膜mRNA疫苗，并能够对每个相关细胞的基因治疗制剂进行高通量筛选。