该协议具有重要意义，因为它演示了如何在一个简单的步骤中制备封装的聚合物纳米颗粒。该技术的主要优点是多功能性，因为它可以应用于不同的核酸和细胞类型。使用简单的程序进行颗粒制备，例如上下移液，以及通过冻干延长纳米颗粒和滚筒条件的稳定性的可能性。
演示该程序的将是Laura Olmo，Coral Garcia-Fernandez，Maria Stampa Lopez-Pinto和Maria Navalon-Lopez，我们实验室的博士生以及我们实验室的博士后Marta Diaz-Caballero。对于多链形成，解冻先前制备的聚合物，C6肽，聚β氨基酯，并涡旋溶液。上下移液聚合物混合物后，在乙酸钠中制备12.5毫摩尔溶液。
涡旋溶液并等待10分钟。接下来，以每毫升0.5毫克的速度制备mRNA，并通过移液混合。再次涡旋聚合物溶液，然后将聚合物溶液中的遗传物质溶液在微量离心管中以一比一的比例混合，并将管在25摄氏度下在热块中孵育30分钟。
孵育后，通过将样品加入含有水的微量离心管中，用一到两个RNase游离水沉淀混合物，然后包括赋形剂，加入与mRNA和聚β氨基酯混合物相同体积的20毫摩尔堆和4%蔗糖溶液，并通过移液混合。为了在零下80摄氏度下冷冻多孔溶液一小时后冻干，进行初级干燥，然后立即将多聚物储存在零下20摄氏度以避免再水化。对于多链重悬，从零下20摄氏度的冰箱中除去冻干的纳米颗粒，并迅速加入相应量的深层氢化水以重新分散固体并达到所需的浓度。
轻轻移液直至完全重悬，溶解后，上下大力移液，避免气泡。转染24小时后，通过荧光显微镜进行定性评估，将含有转染Hela细胞的96孔板放在显微镜上，然后开始使用10倍物镜进行可视化。首先，应用白平衡为软件创建背景参考，然后在分析过程中获取图像以将其与荧光图像叠加。
将显微镜模式更改为反射模式，并将滤光片轮移动到蓝色激光器以可视化EGFP。然后使用相同的曝光时间获取所有条件或孔的图像。对于流式细胞术的定量评估，使用每孔100微升PBS在96孔板中洗涤转染的Hela细胞。
将PBS以每孔25微升胰蛋白酶吸出并在37摄氏度下孵育5分钟后。一旦细胞分离，加入先前回收的培养基以灭活胰蛋白酶，然后通过每孔添加31.25微升10%福尔马林并孵育20分钟来固定细胞。接下来打开流式细胞仪和软件，然后为实验设置适当的条件，包括板样品体积的类型和其他参数，例如样品之间的振荡和漂洗。
设置适当的参数来量化阳性转染细胞的百分比，方法是首先查看前向散射光与侧向散射光的流动数据，以区分细胞和碎片。然后绘制另一个散点图，比较振幅与高度到门并区分单个单元格。转染前一天，将每孔板10， 000个JAWS II细胞放入96孔板中过夜孵育。
第二天，用每孔0.6微克mRNA转染细胞，并将板在37摄氏度和5%二氧化碳的干燥空气培养箱中孵育24小时。第二天，用25微升PBS洗涤留在孔中的细胞。在25微升胰蛋白酶下吸入PBS并在37摄氏度下孵育板五分钟后分离细胞。
通过将先前恢复的培养基添加到相应的孔中来停止胰蛋白酶反应。然后离心板，吸出培养基，并通过每孔添加50微升PBS和2.5%福尔马林来固定细胞，然后将板在4摄氏度下孵育20分钟，离心板。然后每孔加入50微升PBS和3%BSA，并在4摄氏度下培养30分钟。
孵育后再次离心板，然后在PBS和3%BSA中加入50微升小鼠卵清蛋白抗体，并在4摄氏度下培养30分钟。重复离心步骤，然后用50微升PBS洗涤细胞。吸出PBS后，加入二抗并在四摄氏度下孵育一小时。
孵育后，重复离心和洗涤步骤。然后将细胞和100微升PBS和2.5%福尔马林重悬，用于流式细胞术分析。新鲜和冻干GFP mRNA包封纳米颗粒的物理化学表征在尺寸和聚分散度指数方面没有显着差异。
多相束的透射电子显微镜证实了直径约50纳米的球形和单分散纳米颗粒的形成。乐高肽和修饰的聚β-氨基酯多链体包封GFP或卵清蛋白的包封效率数据根据mRNA的类型没有显着差异。这里显示了JAWS II细胞系中EGFP表达的定性分析，交易后24小时。
定量比较阴性对照。GFP阳性细胞百分比显着更高，与使用经典转染试剂进行的阳性对照相当。卵清蛋白mRNA负载的寡肽和修饰的聚β氨基酸纳米颗粒可以激活树突状细胞，如转染细胞中CD11b和CD86膜标志物的表达明显高于非转染细胞。
我们基于使用mRNA作为活性原理的疫苗接种平台，以及我们专有的聚合物可以适应于预防和癌症治疗。我们可以利用我们的技术来突出对癌症免疫治疗的贡献。因为我们可以将肿瘤相关抗原封装在我们的纳米颗粒中，并在癌症治疗中做出转变。
