阳离子纳米脂质体的生成, 用于高效输送体外转录信使 rna

该协议允许生产安全高效的纳米脂质体，可用作治疗信使RNA的转染工具。这些纳米利波体促进mRNA吸收细胞，从而增加蛋白质表达水平，而不影响细胞的生存能力。该技术的主要优点是快速、轻松地生成具有明确尺寸和均匀分布的稳定纳米脂质体。

此外，它们保护封装的 mRNA 免受降解，并导致长时间的翻译。演示这个程序的将是安东尼娅·林克，一个来自我们实验室的博士生。为了开始这个程序，准备脂质，DC胆固醇和兴奋剂的库存解决方案，通过溶解每一个氯仿到每毫升25毫克的最终浓度。

将溶解的直流胆固醇的40微升与80微升的溶解掺杂剂混合在玻璃瓶中。在气流下蒸发氯仿15分钟。接下来，用硅胶填充干燥器。

将打开的玻璃瓶放在里面，并隔夜吸尘，以确保剩余的氯仿蒸发。由此产生的脂质膜将形成在玻璃瓶内。第二天，加入一毫升无核酸酶水，以补充脂质膜的水分。

和漩涡暂停15分钟。将悬架放入声波浴中一小时。在此之后，根据制造商的说明组装迷你挤出机。

用液体悬浮液填充注射器，并放在挤出机的一侧。将空注射器放在另一侧。将脂质悬浮液通过膜从一个注射器压到另一个注射器，大约 20-25 次以挤出悬浮液。

然后，将纳米脂质在四摄氏度的玻璃瓶中储存，直到准备好使用。首先，在冰上解冻合成mRNA。在打开管子前不久旋转冷冻的mRNA，然后离心。

然后，将合成mRNA的一微克与不同量的纳米脂体悬浮液混合。在室温下短暂离心并孵育20分钟，用于纳米复位形成。然后，将普通细胞介质的毫升添加到纳米立体中，然后通过上下移液混合。

转染前一天准备细胞。因此，板15万个 A549 细胞进入每个井的12井板前一天转染。用5%的二氧化碳和常规细胞培养基在37摄氏度下孵育细胞24小时。

第二天，用一毫升PBS清洗每个准备好的细胞。将一毫升准备好的纳米复利混合物加入其中一个含有 A549 细胞的井中。在常规条件下孵育24小时，分析转染效率，或24-72小时分析转染后细胞的生存能力。

取出上一杯，用一毫升PBS清洗每一个井，以去除剩余的纳米脂质。为了准备细胞进行细胞学，首先将500微升的三辛EDTA添加到每个井中，并在37摄氏度下孵育3分钟，以尝试细胞的辛酸化。接下来，添加 500 微升的常规 FBS 介质，以停止该过程并停用 trypsin。

将细胞在400倍G下离心5分钟。并小心去除上一提液，而不干扰细胞颗粒。用一毫升PBS清洗细胞。

然后将细胞重新悬浮在300微升细胞固定溶液中，并将它们转移到流动的细胞学管中。使用流量环测仪分析488纳米的细胞。要准备荧光显微镜的细胞，在每口井中加入一毫升的冰镇甲醇来修复细胞。

将溶解在PBS中的300纳米摩尔溶液的500微升添加到每一个井中。在黑暗中孵育五分钟。在此之后，取出DAPI溶液，再次用以前储存在零下20摄氏度的100%甲醇清洗细胞。

使用荧光显微镜使用此处所示的激发和发射波长分析细胞。在这项研究中，纳米脂质体产生具有合成改性mRNA的高封装功效。利用RNA定量试剂盒，通过分析未封装的mRNA的可用量，在封装1微克eGFP编码mRNA后，可以分析纳米脂质体的封装功效。

EGFP mRNA封装在不同数量的纳米脂质中后，形成纳米复性可以在体外用细胞孵育，并且可以通过流式细胞切除术24小时后分析eGFP表达细胞的百分比。如这里看到，即使只有一微升的纳米脂质体溶液也足以实现细胞内感染的高转染。当细胞与含有Cy3标记的eGFP mRNA的纳米利波体进行转染时，可以可视化细胞质中eGFP mRNA的存在以及已经产生的eGFP蛋白。

由于使用纳米复位细胞的转染会对细胞产生不良影响，因此在转染后24小时和72小时测试细胞的生存能力。当用2.5或5微升的纳米复用处理细胞时，对细胞的生存能力没有影响。在尝试此过程时，必须记住在无乙醇环境中一直工作，因为这可能会损害纳米脂体稳定性。

在准备和混合DC胆固醇与兴奋剂时，您应该使用玻璃移液器，以避免溶解脂质与塑料移液器尖端的可溶性成分污染。按照此协议，在制备过程中或之后，可以轻松操作生成的纳米脂质。例如，PEG分子或特异性抗体的加入会导致稳定性提高或启动活性组织靶向。

生成的纳米利波索体满足必要的安全方面，并促进mRNA吸收到目标细胞。纳米利波体与特定治疗nRNA复合，可以作出重要贡献，以开发新的mRNA为基础的治疗领域组织工程或替代疗法，例如。