펩티드-폴록사민 나노입자는 잠재적인 폐 mRNA 전달 시스템 중 하나이다. 우리의 프로토콜은 펩타이드-폴록사민 나노 입자를 더 높은 생산성과 효율로 만들어 점막 mRNA 백신의 개발을 용이하게합니다. 이 기술에 필요한 재료는 저렴하며 짧은 시간에 프로토콜을 완료 할 수 있습니다.
상기 펩타이드-폴록사민 나노입자는 효율적인 mRNA 형질감염을 매개하는 능력을 갖는다. 펩타이드-폴록사민 나노입자는 인간 기관지 상피 세포에서 성공적인 mRNA 형질감염을 나타냈으며, 이는 점막 COVID-19 백신, 폐암 치료 및 낭포성 섬유증 유전자 치료에 대한 추가 적용을 의미합니다. 나는 개인이 실험을 시작하기 전에 관련 분야와 프로토콜 및 많은 기술에 대한 기본 지식을 가질 것으로 기대합니다.
메트리디아 루시퍼라아제의 개방 판독 프레임을 합성하고 pUC57 벡터에 클로닝한 후, 섭씨 37도에서 1시간 동안 BamHI 및 KpnI를 사용하여 선형화된 DNA 주형을 제조하였다. 원고에 기재된 바와 같이 T7 전사 키트 및 슈두리딘을 사용하여 mRNA 합성을 위한 20-마이크로리터 부피의 반응을 준비한다. 성분을 철저히 혼합하고 섭씨 37도에서 3 시간 동안 배양하십시오.
이어서, 캡핑되지 않은 IVT mRNA 50 마이크로그램의 2차 구조를 섭씨 65도에서 10분 동안 가열하여 제거한다. IVT mRNA 캡핑에 Cap 1 캡핑 시스템을 사용하고, 섭씨 37도에서 30-60분 동안 S-아데노실메티오닌 및 2'O-메틸트랜스퍼라제를 사용하여 7-메틸구아노신 캡 구조를 변형하여 Cap 1을 제조합니다. 캡핑된 IVT mRNA의 농도를 UV-가시광선 분광광도계로 측정합니다.
RNA 마커를 사용하여 18% 포름알데히드를 포함하는 1% 포름알데히드 변성 아가로스 겔에서 캡핑된 IVT mRNA의 분자 크기를 분석합니다. T704를 뉴클레아제가 없는 물에 가용화하여 폴록사민 704의 밀리리터당 10 밀리그램 스톡 용액을 준비합니다. 펩티드를 뉴클레아제가 없는 물에 가용화하여 펩티드의 밀리리터 원액당 2 밀리그램을 준비한다.
준비된 용액을 섭씨 4도에서 보관하십시오. IVT mRNA를 얼음에서 해동합니다. 튜브를 열기 전에 튜브를 실온에서 3 초 동안 300 배 G로 원심 분리하고 IVT mRNA 용액을 뉴 클레아 제가없는 물로 희석하십시오.
T704 용액을 마이크로리터당 8마이크로그램으로 희석하고 합성 펩타이드 용액을 마이크로리터당 0.555마이크로그램으로 각각 뉴클레아제가 없는 물로 희석하여 T704 및 합성 펩타이드 혼합 용액을 준비합니다. 추가 사용 전에 혼합 용액을 실온에서 15분 동안 인큐베이션한다. IVT mRNA 용액을 1 밀리리터 주사기에 넣고 주사기 팁의 공극이나 기포를 피하십시오.
주사기를 회전 블록 옆에있는 카트리지의 한쪽면에 넣습니다. 그런 다음 1 밀리리터 주사기에 T704 및 합성 펩타이드 혼합 용액을 채우고 주사기 끝의 기포 또는 에어 갭을 제거합니다. 주사기를 펌프의 다른 입구에 놓고 분당 4-10 밀리리터의 총 유량으로 펌프를 설정하십시오.
혼합 장치의 유로 끝에 혼합 IVT mRNA / PP-sNp 용액을 수집하기 위해 10 밀리리터 RNase가없는 원추형 튜브를 놓습니다. 펌프를 실행하여 혼합을 시작하고 매개 변수가 올바르게 입력되었는지 확인하십시오. 6초 동안 펌프를 가동한 후 원뿔형 튜브에서 IVT mRNA/PP-sNp 샘플을 수집합니다.
인간 기관지 상피 세포 및 수지상 세포주를 형질감염 24시간 전에 96-웰 플레이트에 플레이트시켰다. 10% 열 불활성화 태아 소 혈청과 1% 페니실린 스트렙토마이신이 보충된 배양 배지에서 세포를 성장시킵니다. 성장 배지를 제거한 후, 플레이팅된 세포를 웰당 0.2 밀리리터 PBS로 세척한다.
170 마이크로리터의 무혈청 배양 배지를 플레이팅된 세포 배양물을 포함하는 각 웰에 첨가한다. 그런 다음 0.4마이크로그램의 메트리디아 루시퍼라아제 mRNA를 포함하는 30마이크로리터의 IVT mRNA/PP-sNp 제형을 각 웰에 현명하게 추가합니다. IVT mRNA / PP-sNp 제형으로 세포를 섭씨 37 도의 가습 된 5 % 이산화탄소가 풍부한 분위기에서 4 시간 동안 배양합니다.
형질주입 배지를 흡인하고 10% 열 불활성화 태아 소 혈청과 1% 페니실린 스트렙토마이신이 보충된 신선한 배양 배지 0.2밀리리터를 추가합니다. 앞서 입증된 바와 같이 형질감염된 세포를 24시간 동안 인큐베이션하고, 각 웰로부터 검출될 상청액을 수집한다. 코엘렌테라진 기질에 PBS를 첨가하여 새로운 분석 용액을 준비합니다.
10 초 동안 와동하여 용액을 완전히 혼합하십시오. 수집된 상청액 50 마이크로리터를 96-웰 플레이트에 첨가한다. 1, 000 밀리 초의 판독 시간으로 마이크로 플레이트 리더를 설정하고 수동 또는 자동 주입으로 각 웰에 30 마이크로 리터의 콜렌 테라 진 용액을 첨가하십시오.
상청액에 코엘렌테라진 용액을 첨가한 직후, 시작을 클릭하여 발광 신호를 측정합니다. 재조합 플라스미드를 단리하고 소화시켜 선형화된 DNA 주형을 생성하였다. 시험관내 전사는 상향 캡핑되고 캡핑된 MetLuc mRNA를 생성하였다.
메트리디아 루시퍼라아제 mRNA/PP-sNp로 형질감염된 세포는 시판되는 지질 기반 형질주입 시약, 네이키드 메트리디아 루시퍼라아제 mRNA, PBS 또는 T7044 합성 펩타이드, 인간 기관지 상피 세포의 혼합 용액, 16 HBE 및 수지상 세포주 DC2.4로 형질감염된 세포에 비해 유의하게 더 높은 루시퍼라아제 발현을 나타냈습니다. MetLuc mRNA를 분해로부터 보호하고 외인성 메트리디아 루시퍼라제 mRNA의 형질감염 효율을 촉진합니다. 캡이 없는 Met-mRNA의 합성 구조가 성공적으로 제거되었는지 확인하십시오. Met-mRNA T704와 펩타이드 화합물을 신중하게 계산하고 다운로드하여 폴록사민 나노입자를 준비하고 압축합니다.
투과전자현미경을 수행하여 펩타이드-폴록사민 나노입자의 형태를 관찰할 수 있다. 이 기술은 연구자들이 점막 mRNA 백신을 개발하고 모든 관련 세포에 대한 유전자 치료 제형의 고처리량 스크리닝을 가능하게 하는 데 도움이 됩니다.
