Un serio ostacolo per il trattamento del cancro è l'accesso limitato delle terapie alle cellule tumorali più profonde a causa delle barriere fisiologiche. Pertanto, lo sviluppo di nuovi trasportatori molecolari in grado di trattare le barriere biologiche è fortemente desiderato per migliorare l'efficienza della somministrazione dei farmaci. Lo scopo di questa procedura è sintetizzare i peptidi ciclici che penetrano nelle cellule per una maggiore penetrazione da cellula a cellula.
Il vantaggio di questo metodo è che la ciclizzazione del peptide può essere facilmente raggiunta attraverso reazioni di sostituzione con cisteine e resina senza richiedere catalizzatori metallici. L'incorporazione di legami incrociati aromatici migliora l'idrofobicità complessiva dei peptidi rispetto ai legami incrociati idrofili o triazolici, migliorando così la loro permeabilità. Per iniziare, assemblare l'apparato manuale di sintesi peptidica nella cappa aspirante.
Posizionare i rubinetti a tre vie sul collettore del vuoto e collegarli all'azoto. Assicurati di tappare le prese inutilizzate. Fissare una colonna di polipropilene da 10 millilitri sui rubinetti di arresto a tre vie e scaricare la miscela di reazione o i solventi dalla colonna di polipropilene utilizzando una lampadina per pipette di gomma o un vuoto tramite una trappola per rifiuti.
Per preparare la resina per la sintesi peptidica, aggiungere da 4 a 5 millilitri di DMF alla quantità richiesta di resina e trasferirla alla colonna di polipropilene con un delicato gorgogliamento di azoto per 30 minuti per gonfiare adeguatamente la resina. Drenare il DMF e aggiungere da 4 a 5 millilitri di 50% morfolina/DMF alla resina. Raccogliere delicatamente l'azoto per 30 minuti per rimuovere il gruppo Fmoc N-terminale, quindi scolare la miscela.
Lavare accuratamente la resina tre volte aggiungendo da 4 a 5 millilitri di DMF alla colonna e gorgogliando con azoto per almeno 1 minuto ogni volta. Allo stesso modo, lavare la resina con diclorometano tre volte e DMF tre volte. Quindi, sciogliere 648,8 milligrammi di Fmoc e arginina protetta da PBF e 372,6 milligrammi di HATU in 5 millilitri di DMF in una provetta da centrifuga.
Aggiungere 348,4 microlitri di DIPEA per attivare la reazione di accoppiamento e trasferire la miscela di reazione alla colonna di polipropilene con resina. Agitare delicatamente la miscela con gorgogliamento di azoto per 1 o 2 ore, quindi ripetere la reazione di accoppiamento una volta. Scolare la miscela di reazione e lavare la resina in sequenza con DMF, diclorometano e di nuovo DMF tre volte ciascuna per almeno 1 minuto ogni volta.
Rimuovere il gruppo protettivo Fmoc e lavare la resina seguendo la procedura illustrata in precedenza prima di procedere all'accoppiamento dell'amminoacido successivo. Successivamente, accoppiare la beta-alanina come distanziatore per l'etichettatura FITC utilizzando lo stesso processo mostrato per l'accoppiamento degli aminoacidi, quindi aggiungere una miscela di FITC, DIPEA e DMF alla colonna di polipropilene al buio per eseguire l'etichettatura FITC dei peptidi sulla resina. La reazione richiederebbe quasi 8 ore.
Per eseguire la ciclizzazione del peptide lineare, aggiungere una miscela di acido trifluoroacetico, triisopropilsilano e diclorometano alla colonna di polipropilene per 2 minuti per rimuovere selettivamente il gruppo di protezione del tritile della cisteina. Scolare la miscela e ripetere la procedura fino a quando la soluzione giallastra diventa incolore per rimuovere completamente il gruppo di protezione del tritil. Eseguire lavaggi sequenziali della resina con DMF e diclorometano almeno tre volte e sciogliere 4, 4'bis-bromometil-bifenile in DMF con DIPEA.
Aggiungi la soluzione alla colonna e reagisci per 4 ore. Lavare la resina con 4-5 millilitri di metanolo due volte per cinque minuti ciascuno e asciugarla con un flusso continuo di azoto. Per i peptidi contenenti cisteine, trattare la resina con un efficace cocktail di scissione di acido trifluoroacetico, triisopropilsilano e acqua o acido trifluoroacetico, triisopropilsilano, 1, 2-etanedithiol e acqua.
Trattare la resina legata al peptide per 2 o 3 ore per scindere il peptide, quindi rimuovere accuratamente l'acido trifluoroacetico con un flusso di azoto. Per ottenere i peptidi grezzi, aggiungere da 4 a 5 millilitri di etere etilico alla preparazione del peptide scisso per precipitare i peptidi grezzi e centrifugare a 10.000 x g per 4 minuti. Scartare con attenzione il surnatante e asciugare all'aria il peptide per 3 minuti in una cappa aspirante efficace.
Sciogliere il peptide grezzo su piccola scala in 800 microlitri di acetonitrile, quindi analizzarlo utilizzando la cromatografia liquida ad alte prestazioni a fase inversa e la cromatografia liquida-spettrometria di massa. Inoculare 100.000 cellule HeLa in 2 millilitri di DMEM in una camera a 12 pozzetti con un inserto in piastra di coltura tissutale e incubare per 24 ore in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius contenente il 5% di anidride carbonica. Rimuovere il mezzo e incubare le cellule nelle camere con 1 millilitro di 10 micromolari FITC-R8 o FITC-sR8-4 in DMEM privo di FBS per 1 ora.
Successivamente, rimuovere il mezzo contenente i peptidi e lavare le cellule tre volte con 1 millilitro di PBS. Aggiungere 1 millilitro di DMEM fresco privo di FBS alle camere, quindi co-incubare le cellule HeLa nella camera con l'inserto della piastra di coltura tissutale, con le cellule HeLa sui coperchi rotondi sul fondo per 2 ore. Fissare le cellule HeLa sui coprivetrini rotondi con glutaraldeide al 2,5% per 15 minuti, quindi colorare le cellule con DAPI per 15 minuti.
Infine, osservare le cellule HeLa sui vetrini sotto un microscopio a fluorescenza. Un diagramma schematico della sintesi del peptide R8 lineare marcato con FITC e del peptide R8 graffato marcato con FITC è presentato qui. Gli spettri HPLC e MS del peptide lineare R8 e del peptide R8 pinzato sono mostrati in questa figura.
Il tempo di ritenzione del peptide pinzato era sostanzialmente più lungo di quello dell'analogo lineare, indicando una maggiore idrofobicità complessiva del peptide dopo la ciclizzazione con il cross-link idrofobico. Questa immagine grafica rappresenta la stabilità del peptide lineare e del peptide pinzato in presenza del 25% di FBS. L'R8 ciclico rimane intatto al 77,3% dopo l'incubazione con FBS per 4 ore, mentre la sua controparte lineare è stata per lo più degradata, suggerendo una maggiore stabilità proteolitica del peptide ciclico R8.
Qui sono mostrate immagini al microscopio a fluorescenza di cellule HeLa e cellule 4T1 dopo 1 ora di incubazione con 3 peptidi R8 lineari marcati con FITC micromolari e peptide R8 pinzato marcato con FITC. Si può vedere che le cellule trattate con R8 ciclico con reticolazione aromatica hanno mostrato una fluorescenza intracellulare più elevata rispetto a quelle trattate con la loro controparte lineare. Risultati simili sono stati ottenuti con l'analisi della citometria a flusso.
Per indagare ulteriormente se l'R8 ciclico conferisce una maggiore penetrazione da cellula a cellula, sono stati utilizzati modelli transwell per simulare la permeabilità barriera dei peptidi da uno strato cellulare all'altro. L'R8 ciclico ha chiaramente mostrato una maggiore penetrazione trans-barriera rispetto al peptide lineare R8, come indicato da un significativo aumento della fluorescenza intracellulare. La completa deprotezione del gruppo tritilico di cisteina e resina è importante per la successiva fase di ciclizzazione.
Inoltre, l'efficienza di ciclizzazione dipende anche dalle sequenze specifiche e dalle lunghezze dei peptidi dovuti agli effetti sterici. In tal caso, sarebbe utile utilizzare una resina con minore capacità di carico o ciclizzazione dei peptidi sotto concentrazioni diluite in fase di soluzione. Questi peptidi ciclici hanno mostrato una maggiore permeabilità cellula-cellula rispetto alle loro controparti lineari.
Crediamo che siano molto promettenti per superare le barriere biologiche e saranno utilizzati come molecolari per ulteriori applicazioni nel campo della somministrazione di farmaci.
