在该协议中，构建了锍盐，可以充当与蛋白质半胱氨酸在特殊接近处反应的新手。该技术的优点是该反应快速高效，并且不含Met催化剂，并开发了一种简单有效的稳定肽的方法。首先，在500毫升烧杯或烧瓶中制备20%哌啶或50%吗啉和DMF的N-末端9-芴基-甲基氧羰基脱保护溶液。
然后，向色谱柱中加入10毫升脱保护溶液，并向溶液中注入氮气30分钟或两次，持续5分钟。通过真空泵排出溶液，并依次用二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂五次。要检测树脂为深黄色溶液，在少量树脂中加入一毫升N，N-二甲基甲酰胺，并向玻璃管中加入200微升5%茚三酮。
在130摄氏度下加热三分钟，以评估树脂颜色的变化。对于肽的偶联，在聚丙烯管中制备手稿中所述的混合物溶液，并将其溶解在三毫升N，N-二甲基甲酰胺中。然后，向溶液中加入173微升N，N-二异丙基乙胺或154微升N，N'二异丙基碳化二亚胺以使氨基酸失活。
接下来，将混合物加入装有树脂的色谱柱中，并用氮气鼓泡两个小时。偶联后，在少量树脂中加入1毫升N，N-二甲基甲酰胺，向玻璃管中加入200微升5%茚三酮。在130摄氏度下加热三分钟，同时树脂变为无色，这证实了在脱保护步骤之前没有游离氨基。
排干溶液后，如前所述洗涤树脂，并向色谱柱中加入10毫升脱保护溶液。然后，用氮气搅拌 30 分钟或两次，持续 5 分钟。再次，添加新鲜的溶液。
向带有树脂的色谱柱中加入10毫升无水甲醇进行脱水，并用氮气干燥以备下次使用。称取100毫克树脂到柱中，并在偶联步骤之前用二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂。通过在100毫升烧杯或烧瓶中加入三氟乙酸，三异丙基硅烷和二氯甲烷混合物来制备用于去除三苯甲基-L-半胱氨酸保护基的溶液，以除去保护基。
向色谱柱中加入5至10毫升制备的溶液以除去保护组10分钟。用氮气鼓泡重复六次，直到黄色完全消失。通过真空泵排出溶液后，如前所述清洗树脂。
然后，通过在50毫升烧杯或烧瓶中加入二卤接头和N，N-二异丙基乙胺与N，N-二甲基甲酰胺，制备与脱保护半胱氨酸反应的溶液。向色谱柱中加入5至10毫升的反应溶液，与受保护的半胱氨酸反应至少3小时，氮气鼓泡。同样，通过真空泵排出溶液并按顺序洗涤树脂，如前所述。
为了制备肽环化溶液，将三氟乙酸混合物加入通风橱中的20毫升烧杯或烧瓶中进行肽环化。然后，将5至10毫升的混合物溶液加入聚丙烯管中，并在三氟乙酸混合物下将树脂切割三小时。在脱水和洗涤树脂之前演示的偶联步骤之前，制备1%甲酸水溶液和1毫摩尔丙炔基溴，并加入到蛋氨酸肽溶液中。
接下来，在室温下摇动蛋氨酸和炔丙基溴的偶联反应12小时。反应后，将产物溶解在聚丙烯管和乙腈中，并通过0.22微米的过滤膜过滤。然后，立即通过反相HPLC纯化溶液，并将其冷冻干燥成粉末以备下次使用。
采用HPLC和LCMS光谱对半胱氨酸和蛋氨酸双烷基化合成的环状肽进行了表征， 结果表明差向异构体具有不同的保留时间和相同的分子量.差向异构体及其偶联产物的HPLC迹线证明了环肽与其产物之间的时间依赖性转化。采用LCMS法测定硫醇-炔型反应合成的环肽分子量，并用HPLC分离纯化肽。
通过质子核磁共振和异核单量子相干光谱进一步表征了肽，揭示了其化学位移。获得了环状肽与二硫苏糖醇和氧化氘之间时间依赖性转化的质子核磁共振波谱，以探索肽因锍环打开而具有的稳定性。结果表明，24 h后未形成添加物或开环产物。
该程序建立了合成环肽的有效策略。该反应表示，通过形成稳定环化肽的确认，选择性也得到了增强，表明环肽是有前途的药物催化剂。
