脑室微注射脂多糖到斑马鱼幼虫中以评估神经炎症和神经毒性

神经炎症是各种神经系统疾病的关键因素。因此，研究和开发替代体内神经炎症模型以促进病理发展研究具有极大的意义。这里描述的技术是通过体内成像更好地了解大脑病理变化的绝佳工具，并用于快速有效地评估可能的抗神经炎症药物。

按照玻璃毛细管拉动的五步方案，使用微量移液器拉动玻璃毛细管，准备注射。使用镊子以一定角度将针尖打开到适当的尺寸。用0.1毫升矿物油填充针头，以确保没有气泡。

取下显微注射装置钢针的螺帽。将玻璃针孔与钢针对齐，然后拧紧螺帽。将装载的针头显微注射装置安装在显微操纵器中。

调整显微注射装置的位置，使显微操纵器可以在显微镜下灵活地移动装置。排出适量所需的石蜡油，使钢针进入毛细管玻璃管。将由PBS或脂多糖组成的注射液滴在用70%乙醇灭菌的载玻片上，并调整显微注射装置，使尖端插入液滴中。

将大约两微升注射液装入针中。设置显微操纵器，使显微注射装置的针尖与高倍率下的幼虫处于同一视野。使用微波炉在双蒸水中融化2%琼脂糖的溶液。

将熔融的琼脂糖倒入塑料盘中。使用塑料移液管将麻醉的幼虫运送到2%琼脂糖涂层塑料培养皿的中心。将安装的幼虫定向，大脑一侧朝上以便针头进入。

调整显微镜的放大倍率，使斑马鱼的脑室结构在视野中清晰显示。小心地将针头放在脑顶上方。用70%乙醇清洁大脑区域，并使用显微操纵器用针尖缓慢刺穿斑马鱼大脑的皮肤。

踩下脚踏板可喷射一纳升 1X PBS 或不同浓度的脂多糖。注射后立即将幼虫转移到干净的E3培养基中。24小时后，收集幼虫进行显微镜成像，机车行为测定和其他指标的测定。

在E3培养基中制备1.5%低熔点琼脂糖溶液，并在微波炉中加热以形成透明液体。使用干净的塑料移液管将幼虫运送到载玻片上，并尽可能多地去除水分。使用塑料移液管向幼虫中加入一滴1.5%低熔点琼脂糖。

使用一毫升注射器针头定向幼虫。等到琼脂糖冷却并凝固后再开始成像。在脂多糖脑室注射后24小时，继续测定基因表达标志物。

使用两个一毫升注射器分离幼虫的头部部分，没有眼睛和卵黄囊区域。使用组织研磨机以每分钟11， 000转的速度用200微升RNA提取试剂匀浆头部，持续5秒，然后使用氯仿异丙醇方法进行RNA提取。将RNA沉淀风干5至10分钟，然后加入30微升无RNA酶的水以溶解RNA沉淀。

使用具有随机引物的逆转录酶合成cDNA，如文本手稿中所述。接下来，使用市售的RT-qPCR试剂盒在qPCR系统上进行实时PCR以确定靶基因的表达。在脂多糖脑室注射后24小时，将斑马鱼幼虫分别转移到96孔方形微孔板的孔中。

向每个孔中加入300微升E3培养基，然后将幼虫孵育4小时以适应测试板。将装载幼虫的微孔板转移到斑马鱼跟踪箱中。打开光源，将幼虫在测试箱中孵育30分钟，以适应环境。

使用自动视频跟踪系统监控和记录斑马鱼的行为。为单个斑马鱼幼虫记录 12 个会话，每个会话 5 分钟，并定义文本手稿中所述的总距离。治疗24小时后，与对照组和假组相比，每毫升脂多糖脑室脑注射1至5毫克诱导TgEtvmat2:GFP幼虫斑马鱼脑中RA神经元显着丧失。

转基因系elavl3:mCherry斑马鱼注射每毫升脂多糖2.5-5毫克时，幼虫脑神经元的荧光积分密度有显著变化，而每毫升脂多糖注射1毫克则无效果。此外，每毫升脂多糖5毫克诱导运动缺陷，并在60分钟的跟踪期内缩短斑马鱼运动的总距离。与对照组和假组相比，斑马鱼幼虫头部的一氧化二氮产生和促炎细胞因子的mRNA表达量在每毫升脂多糖处理中增加2.5至5毫克。

每毫升注射1至5毫克脂多糖表明中性粒细胞募集到幼虫斑马鱼脑中，导致Tgmpo:eGFP斑马鱼脑区中性粒细胞数量显着增加。针头的开口尺寸和显微注射的注射力以及头部与斑马鱼眼睛和身体的分离对于此过程至关重要。