该协议描述了一种将感兴趣的药物对准幼虫斑马鱼巨噬细胞的技术，以操纵和评估巨噬细胞功能。与传统的药物输送策略相比，该技术具有优势，例如通过确保药物通过脂类体封装专门针对巨噬细胞进行浸入式药物。当应用于具有炎症成分的斑马鱼疾病模型时，这种技术有可能解决巨噬细胞如何促进病理过程。
在这里，我们演示了这项技术的效用，将线粒体反应性氧种抑制药物靶向巨噬细胞抑制活化。药物加载的脂质体对幼虫的微注射可能具有挑战性，因为应注意不要造成过度的上皮损伤，从而可能影响免疫学研究。该协议的视觉演示很重要，因为它涉及药理学和整个动物活细胞方法，这些方法可能不会在单个实验室中常规进行。
要在25毫升的圆底烧瓶中准备10毫克脂质体，在烧瓶中加入31个海洋蓝纳米摩尔和300纳米摩尔的线粒体反应性氧物种抑制药物。短暂声波，以完全溶解，并在真空压力下每分钟75次旋转的旋转蒸发器上缓慢地去除溶剂。当在烧瓶的玻璃壁内形成干脂薄膜时，在氮气下进一步干燥薄膜45分钟，以方便有机溶剂的完全去除。
接下来，用一毫升PBS水合薄膜，用石蜡膜密封烧瓶，然后用手在60摄氏度的水浴中搅拌烧瓶20分钟。经过七个循环的冷冻和解冻后，使用微型挤出机和一微米轨道蚀刻聚碳酸酯膜将脂质体挤出两到六个循环。获得大型单核囊泡后，通过超离心将新鲜的脂质体浓缩成颗粒。
在具有两毫升微离温管附件的 ThermoMixer 中，用 1%poloxamer 188 溶液的一毫升孵育颗粒，在 45 摄氏度下孵育 30 分钟，每分钟旋转 750 次。在将马球菌188插入脂质体后，正确的马球菌浓度、孵化时间和温度对于实现所所得脂质体的最佳物理化学特性非常重要。在孵育结束时，在相同的离心机条件下再次对混合物进行超离心机，并去除含有任何未绑定聚合物或药物的上流液。
然后将脂体颗粒储存在摄氏四度，防止光线。要确定脂质体的大小和泽塔电位，请用超纯水以 1 比 100 的比例稀释脂质体配方。使用动态光散射分析仪测量 25 摄氏度时三倍的颗粒大小、多散射指数和 Zeta 电位。
要计算脂质体诱捕效率和药物负荷，请溶解Triton X-100中的脂质体。将 20 微升溶解脂体样品注入高压液相色谱系统中，并配有四元泵、230 纳米的二极管阵列检测器以及三微米、250 倍-4.6 毫米柱。为准备注射转基因斑马鱼幼虫，使用细尖钳手动对受精后30小时的胚胎进行脱毛，并允许胚胎在28.5摄氏度下发育，直到受精后两天。
当胚胎达到适当阶段时，在无菌PBS中以一比一的比例稀释新鲜准备的脂体配方，通过涡旋混合溶液两到三秒钟。将足够的 3%甲基纤维素倒入 35 毫米培养小盘盖的盖子中，形成覆盖整个表面的薄膜。使用塑料转移移液器收集大约 20 到 25 个麻醉幼虫的池。
允许胚胎通过重力浓缩在移液器的尖端，并小心地将幼虫转移到35毫米培养盘盖的中间，用最少的溶液。使用微胶囊装载机将幼虫的前部朝向注射板顶部，背部朝向微注射针，用于注射到后脑心室，或将幼虫朝向注射板左侧，其腹体朝向微注射针，以注射到鼻窦内。使用微胶囊装载机用大约五微升的脂体注射混合物对注射针进行背填。
将针头安装到连接到磁性支架和压力喷油器的微操纵器中，并在立体显微镜下放置设置。使用清洁、细尖钳切割微注射针的尖端，产生直径约 5 微米的开口。将喷油器设置为大约 50 毫秒的脉冲持续时间和每平方英寸的喷射压力约为 40 磅。
将一玻油注入位于血细胞计网格线上的矿物油中，以校准要注入的体积。然后调整脉冲持续时间和/或喷射压力，直到波卢斯的直径覆盖最小栅格线的 2 1/2。小心地将脂体注射混合物的一纳米光注入到每个幼虫的后脑心室。
注射后，立即将E3培养基加入注射板，并使用塑料转移移液器轻轻搅拌幼虫的甲基纤维素。要在装有水浸透镜的共体显微镜上成像后脑的后脑表面，首先将 35 毫米培养盘填充到 5 毫米的深度，并安装介质，然后让介质聚合。在足够面积的黄鼠伯中挖掘一条小沟，以容纳实验胚胎的蛋黄囊，并使用填充熔融安装介质的塑料转移移液器收集麻醉幼虫。
立即将幼虫放入培养皿中，并使用微胶囊式装载机将蛋黄囊腹侧向下定向到挖掘的孔中。保持胚胎在此位置，直到红糖聚合。用E3介质覆盖胚胎，每毫升三分素补充200微克。
要对后脑心室进行实时图像，请选择 20 倍目标，然后将共声显微镜设置为 512 x 512 像素和 2.5 倍变焦。设置显微镜参数后，利用双通道成像从后脑最后脑的后脑表面获得 40 到 3 微米的 Z 堆栈，以成像蓝色荧光脂质体和绿色荧光巨噬细胞。获得所有图像后，将文件加载到适当的 3D 图像分析软件程序中。
在"测量"选项卡下，将"查找对象"协议拖动到"在此处拖动任务以进行测量"空间。选择 DAPI 通道以突出显示脂质体，然后拖动检查工具通过 Z 节来检测脂质体大噬细胞。要量化单个细胞中脂质体中的荧光强度，请将"剪辑到感兴趣的区域"协议拖动到"此处拖动任务以进行测量"空间，并使用矩形工具在 X、Y 和 Z 维度中感兴趣的单元格周围绘制一个框。
然后从"测量"下拉菜单中选择"使测量项目"，以在库窗口中生成测量文件。在该表中，总结了所生产脂质体的大小、泽塔潜力、药物载荷和诱捕效率。正如所观察到的，脂质体颗粒大小与药物加载和没有药物加载相似，尽管药物加载脂质体的表面电荷比仅使用海洋蓝色的控制脂质体略中性。
如所证明，海洋蓝标脂质体微注射到后脑心室，导致居民巨噬细胞迅速吸收，注射后三小时即可通过共声显微镜进行量化。然而，很少观察到嗜中性粒细胞含有细胞内脂质体。在单个脂质体中，脂质体在噬菌体中积累，这是脂质体降解和随后药物含量释放到细胞质所必需的。
传递到鼻窦，可以通过循环将脂质体送到造血组织居民巨噬细胞。将含有线粒体活性氧种抑制药物的脂质体微注射到后脑心室，可显著抑制脂质体-后脑-居民巨噬细胞内尿酸晶体驱动的单体尿酸反应性氧物种的产生。通过研究全安装原位杂交和中性粒细胞的时态征，可以进一步验证感兴趣的药物对巨噬细胞活化状态的抑制作用。
利用这项技术，我们已经能够将药物靶向巨噬细胞，以确认免疫代谢机制驱动其在急性痛风炎症幼虫斑马鱼模型中的激活。该协议的未来适应可以包括执行脂体的表面修饰，以提高巨噬细胞靶向或促进瞄准其他免疫细胞，如嗜中性粒细胞。
