纳米巴支持的脂质双层系统，用于体外研究膜曲率传感蛋白

这种纳米棒支持的脂质双层系统可用于研究膜曲率在调节细胞活动期间蛋白质和脂质的动力学和分布中的作用。该技术通过在专利纳米巴误差上形成连续的脂质双层，通过高分辨率纳米制造预定义的膜曲率，在膜曲率生成中提供高亚根和不良。首先，将纳米芯片放入 10 毫升烧杯中，图案面朝上。

小心地在烧杯中加入一毫升98%的硫酸，并确保酸完全覆盖芯片的正面和背面。慢慢旋转烧杯，一滴一滴地加入 200 微升 30% 过氧化氢，直到整个烧杯变热。确保硫酸和过氧化氢充分混合形成食人鱼溶液，用于从纳米芯片中去除有机分子。

将烧杯放入二次玻璃容器中，并将纳米芯片浸入食人鱼溶液中过夜，以彻底清洁杂质。取出烧杯，小心地将食人鱼溶液移入酸性废物容器中。将五毫升去离子水装入烧杯中以稀释残留的酸并将其丢弃到酸性废物中。

重复此步骤五次。用镊子抓住芯片，用连续的去离子水流清洗，彻底去除残留的酸。用99.9%的氮气吹干芯片以形成SLB。

超声处理脂质混合物30分钟。将脂质混合物在液氮中冷冻20秒，然后在水浴中以42摄氏度解冻两分钟。重复冻融循环30次。

之后，脂质混合物看起来像透明液体。将脂质混合物通过小型挤出机并来回挤出20次。从另一侧的注射器中收集SUV，以减少较大颗粒或异物的污染，并将其转移到1.5毫升离心管中。

用镊子小心地从去离子水中取出清洁的纳米芯片，并用99.9%的氮气吹干。用空气等离子处理对纳米芯片进行一小时的表面清洁。将纳米芯片组装在PDMS室中。

首先将芯片放在干净的表面上，图案朝上。用芯片轻轻覆盖中间的PDMS，并确保整个图案暴露在中间PDMS中椭圆形大开口的中心区域。用中间的PDMS覆盖顶部的PDMS，并将其两个小孔保留在中间PDMS的大椭圆孔区域内。

然后，组装PDMS室。用移液管将SUV从顶部PDMS上的两个小孔之一装入PDMS通道，并在室温下孵育15分钟以形成SLB。从小孔的一侧轻轻地将PBS缓冲液移入PDMS通道，然后用棉签从另一个孔中清除废物，以洗掉未绑定的SUV。

然后获取在纳米芯片上形成的SLB。使用100 x油物镜设置激光扫描共聚焦显微镜。打开Zen软件，选择可以激发脂质和蛋白质荧光的激发激光功率。

选择采集模式。然后单击智能设置，然后单击德州红。使用对焦旋钮调整焦点以定位芯片上的纳米条，直到纳米条边缘在脂质通道下方清晰。

在添加蛋白质之前，设置扫描参数以获得脂质通道的控制图像。通过在随机的单个纳米巴区域上用荧光标记的脂质双层漂白来进行 FRAP 测定。选中"实验区域"和"漂白"复选框。

画一个直径为五微米的圆形区域，其中可以包括中心的整个纳米棒，并添加到实验区域。输入延时摄影成像参数。选择时间序列。

然后单击持续时间。选择 100 个周期，间隔等于 2 秒。输入漂白参数。

选中执行 FRAP 的激光复选框并将功率更改为 100%单击开始实验以进行 FRAP 实验。将蛋白质溶液加载到PDMS通道中，并在室温下孵育五分钟，以使蛋白质与SLB结合。重新聚焦纳米棒并设置扫描参数，以拍摄脂质和蛋白质通道的图像，以进行蛋白质曲率传感检测。

选择实验区域并在脂质和蛋白质通道上进行FRAP测定，并进行延时成像以表征曲率传感蛋白的迁移率。两者都显示出在SLB涂层的单个纳米棒末端的积累增加，宽度为300纳米。在这里，SLB含有10%PS以静电增强蛋白质结合。

这两种蛋白质的端中心比脂质高，约为1。在比较 IDR FBP17 和 F-Bar 时，IDR FBP17 的端中心比表明比 F-Bar 更强的曲率感应。当曲率减小到直径400纳米以下时，所有3种蛋白质在纳米条末端弯曲膜位点均表现出优先积累。

在这三个蛋白质结构域中，IDR FBP17给出的纳米条和密度最高，表明其最强的曲率传感能力，而F-Bar显示出最低的值。通过逐渐增加蛋白质浓度可以绘制蛋白质结合曲线，表明IDR FBP17具有很强的协同曲率传感能力。与纳米棒上脂质信号的快速恢复相比，F-Bar无法在两分钟内恢复，这表明其在弯曲膜部位的膜迁移率和缔合动态显着降低。

令人惊讶的是，与F-Bar的行为不同，IDR FBP17信号在同一时间范围内表现出明显的恢复，表明IDR FBP17在弯曲膜上积累的动态性质。然而，在洗去溶液中未结合的IDR FBP17后，无法观察到与以前相同的IDR FBP17通道恢复。在研究弯曲膜和蛋白质之间的相互作用时，SLB质量非常重要。

因此，在我们的实验中，FRAP测试对于验证膜迁移率是必要的。该系统将帮助研究人员研究影响蛋白质与弯曲膜相互作用的各种参数，例如曲率传感域和脂质组成，以及对弯曲膜进行动态研究，例如面部分离行为。