Este sistema de bicapa lipídica soportado por nanobarras se puede utilizar para estudiar el papel de la curvatura de la membrana en la regulación de la dinámica y la distribución de proteínas y lípidos durante las actividades celulares. Esta técnica ofrece tanto alta sub raíz como mala en la generación de curvatura de membrana al formar una bicapa lipídica continua sobre errores patentados de nanobar con curvatura de membrana predefinida por nanofabricación de alta resolución. Para comenzar, coloque el nanochip en un vaso de precipitados de 10 mililitros con el lado del patrón hacia arriba.
Agregue cuidadosamente un mililitro de ácido sulfúrico al 98% al vaso de precipitados y asegúrese de que el ácido cubra completamente la parte frontal y posterior del chip. Gire lentamente el vaso de precipitados y agregue 200 microlitros de peróxido de hidrógeno al 30% gota a gota hasta que todo el vaso de precipitados se caliente. Asegúrese de que el ácido sulfúrico y el peróxido de hidrógeno estén bien mezclados para formar una solución de piraña para la eliminación de moléculas orgánicas del nanochip.
Coloque el vaso de precipitados en un recipiente de vidrio secundario y mantenga el nano chip sumergido en la solución de piraña durante la noche para limpiar las impurezas a fondo. Saque el vaso de precipitados y pipete cuidadosamente la solución de piraña en un recipiente de residuos ácidos. Cargue cinco mililitros de agua desionizada en el vaso de precipitados para diluir el ácido residual y desecharlo en los desechos ácidos.
Repita este paso cinco veces. Agarre el chip con pinzas y lávelo con un chorro continuo de agua desionizada para eliminar completamente el ácido residual. Seque el chip con 99.9% de gas nitrógeno para la formación de SLB.
Sonicar la mezcla lipídica durante 30 minutos. Congele la mezcla de lípidos en nitrógeno líquido durante 20 segundos y luego descongele a 42 grados centígrados durante dos minutos en un baño de agua. Repita los ciclos de congelación/descongelación 30 veces.
Después de eso, la mezcla de lípidos parece un líquido claro. Pase la mezcla de lípidos a través de la mini extrusora y extruya hacia adelante y hacia atrás 20 veces. Recoja los SUV de la jeringa en el otro lado para reducir la contaminación con partículas más grandes o material extraño, y transfiéralos a un tubo de centrífuga de 1.5 mililitros.
Saque el nanochip limpio del agua desionizada con cuidado con un par de pinzas y séquelo con 99.9% de gas nitrógeno. Realice la limpieza superficial del nanochip con tratamiento de plasma de aire durante una hora. Ensamble el nano chip en una cámara PDMS.
Comience colocando el chip sobre una superficie limpia con el patrón hacia arriba. Cubra suavemente el PDMS medio con el chip y asegúrese de que todo el patrón esté expuesto al área central de la gran abertura de forma ovalada en el PDMS medio. Cubra el PDMS superior con el PDMS medio y mantenga sus dos orificios pequeños dentro de la región del orificio ovalado grande del PDMS medio.
Luego, se ensambla la cámara PDMS. Cargue los SUV en el canal PDMS desde uno de los dos orificios pequeños en el PDMS superior con una pipeta e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente para formar el SLB. Pipete suavemente el tampón PBS en el canal PDMS desde un lado del orificio pequeño y retire los desechos con un bastoncillo de algodón del otro orificio para lavar los SUV no unidos.
Luego adquiera el SLB formado en el nano chip. Configure la microscopía confocal de escaneo láser utilizando un objetivo de aceite de 100 x. Abra el software Zen para seleccionar la potencia del láser de excitación que puede excitar la fluorescencia del lípido y la proteína.
Elija Modo de adquisición. Luego haga clic en Configuración inteligente, seguido de Texas Red. Ajuste el enfoque con la perilla de enfoque para ubicar las nano barras en el chip hasta que los bordes de la nano barra estén afilados debajo del canal lipídico.
Establezca los parámetros de escaneo para obtener una imagen de control del canal lipídico antes de agregar proteína. Realice el ensayo FRAP blanqueando con bicapa lipídica marcada con fluorescencia en un área aleatoria de nanobar. Active las casillas Regiones de experimento y Blanqueo.
Dibuje un área circular de cinco micrómetros de diámetro que pueda incluir toda la nanobarra en el centro y agregue a las regiones del experimento. Introduzca parámetros de imagen TimeLapse. Elija Serie temporal.
A continuación, haga clic en Duración. Seleccione 100 ciclos e intervalo igual a dos segundos. Parámetros de blanqueo de entrada.
Seleccione las casillas de verificación láser que realizan FRAP y cambie la potencia a 100%Haga clic en Iniciar experimento para el experimento FRAP. Cargue la solución proteica en el canal PDMS e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente para permitir la unión de la proteína en el SLB. Vuelva a enfocar las nanobarras y configure los parámetros de escaneo para tomar imágenes de los canales de lípidos y proteínas para la detección de la curvatura de proteínas.
Seleccione Regiones experimentales y realice el ensayo FRAP en los canales de lípidos y proteínas, y realice imágenes TimeLapse para caracterizar la movilidad de la proteína sensible a la curvatura. Ambos muestran una mayor acumulación en el extremo de nanobarras individuales recubiertas con SLB con 300 nanómetros de ancho. Aquí el SLB contiene 10% PS para mejorar electrostáticamente la unión a proteínas.
Ambas proteínas tienen una relación de extremo a centro más alta que los lípidos, que es alrededor de uno. Al comparar el IDR FBP17 y la F-Bar, la mayor relación extremo a centro del IDR FBP17 indica una detección de curvatura más fuerte que la F-Bar. Las tres proteínas mostraron acumulación preferencial en los sitios de membrana curvada del extremo nanobar cuando la curvatura disminuyó por debajo de 400 nanómetros de diámetro.
Entre estos tres dominios de proteínas, IDR FBP17 proporciona la nano barra y densidad más altas, lo que indica su mayor capacidad de detección de curvatura, mientras que F-Bar muestra el valor más bajo. La curva de unión a proteínas se puede trazar aumentando gradualmente la concentración de proteínas, lo que muestra que IDR FBP17 tiene una fuerte capacidad de detección de curvatura cooperativa. En comparación con la rápida recuperación de señales lipídicas en nanobares, la F-Bar no puede recuperarse en dos minutos, lo que sugiere una movilidad de membrana significativamente disminuida y la dinámica de asociación en los sitios de membrana curva.
Sorprendentemente, a diferencia del comportamiento de F-Bar, las señales IDR FBP17 mostraron una recuperación obvia dentro del mismo período de tiempo, lo que indica la naturaleza dinámica de IDR FBP17 acumulada en las membranas curvas. Sin embargo, después de lavar el IDR FBP17 no unido en la solución, no se pudo observar la misma recuperación en el canal IDR FBP17 como antes. La calidad SLB es muy importante cuando se estudia la interacción entre la membrana curva y la proteína.
Por lo tanto, la prueba FRAP es necesaria en nuestro experimento para validar la movilidad de la membrana. Este sistema ayudará a los investigadores a estudiar diversos parámetros que afectan la interacción de proteínas con la membrana curva, como los dominios de detección de curvatura y la composición lipídica, así como a realizar estudios dinámicos sobre la membrana curva, como los comportamientos de separación de caras.
