Эта липидная двухслойная система, поддерживаемая нанобаром, может быть использована для изучения роли кривизны мембраны в регулировании динамики и распределения белка и липидов во время клеточной деятельности. Этот метод предлагает как высокий подкорневой, так и плохой в генерации кривизны мембраны путем формирования непрерывного липидного бислоя на патентных ошибках нанобара с кривизной мембраны, предопределенной нанофабрикцией высокого разрешения. Для начала поместите наночип в 10-миллилитровый стакан лицом вверх.
Осторожно добавьте один миллилитр 98% серной кислоты в стакан и убедитесь, что кислота полностью покрывает переднюю и заднюю стороны чипа. Медленно поверните стакан и добавьте 200 микролитров 30% перекиси водорода капля за каплей, пока весь стакан не станет горячим. Убедитесь, что серная кислота и перекись водорода хорошо перемешаны с образованием раствора пираньи для удаления органических молекул из наночипа.
Поместите стакан во вторичный стеклянный контейнер и держите наночип погруженным в раствор пираньи на ночь, чтобы тщательно очистить примеси. Выньте стакан и аккуратно выложите раствор пираньи в контейнер для кислотных отходов. Загрузите пять миллилитров деионизированной воды в стакан, чтобы разбавить остаточную кислоту и выбросить ее в кислотные отходы.
Повторите этот шаг пять раз. Возьмите чип пинцетом и промойте непрерывным потоком деионизированной воды, чтобы тщательно удалить остаточную кислоту. Высушите чип феном с 99,9% газообразным азотом для образования SLB.
Настаивайте липидной смесью в течение 30 минут. Заморозьте липидную смесь в жидком азоте на 20 секунд, а затем разморозьте при 42 градусах Цельсия в течение двух минут на водяной бане. Повторите циклы замораживания/оттаивания 30 раз.
После этого липидная смесь выглядит как прозрачная жидкость. Пропустите липидную смесь через мини-экструдер и выдавите туда-сюда 20 раз. Соберите внедорожники со шприца с другой стороны, чтобы уменьшить загрязнение более крупными частицами или посторонним материалом, и перенесите его в 1,5-миллилитровую центрифужную трубку.
Осторожно извлеките очищенный наночип из деионизированной воды с помощью пинцета и высушите его феном с 99,9% газообразным азотом. Выполните очистку поверхности наночипа с помощью обработки воздушной плазмой в течение одного часа. Соберите наночип в камеру PDMS.
Начните с размещения чипа на чистой поверхности с рисунком вверх. Аккуратно накройте среднюю PDMS чипом и убедитесь, что весь рисунок подвергается воздействию центральной области большого отверстия овальной формы в середине PDMS. Закройте верхнюю PDMS средней PDMS и держите два ее небольших отверстия в области большого овального отверстия средней PDMS.
Затем собирается камера PDMS. Загрузите внедорожники в канал PDMS из одного из двух небольших отверстий в верхней PDMS с пипеткой и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре, чтобы сформировать SLB. Аккуратно нанесите буфер PBS в канал PDMS с одной стороны небольшого отверстия и удалите отходы ватной палочкой из другого отверстия, чтобы смыть несвязанные внедорожники.
Затем приобретите SLB, сформированный на наночипе. Настройте лазерную сканирующую конфокальную микроскопию с использованием масляного объектива 100 x. Откройте программное обеспечение Zen, чтобы выбрать мощность лазера возбуждения, которая может возбуждать флуоресценцию липидов и белков.
Выберите Режим получения. Затем нажмите Smart Setup, а затем Texas Red. Отрегулируйте фокусировку с помощью ручки фокусировки, чтобы найти нанобары на чипе до тех пор, пока края нанобара не станут острыми под липидным каналом.
Задайте параметры сканирования для получения контрольного изображения липидного канала перед добавлением белка. Проводят анализ FRAP путем отбеливания флуоресцентным меченым липидным бислоем на случайной области нанобара. Установите флажки Области эксперимента и Отбеливание.
Нарисуйте круглую область диаметром пять микрометров, которая может включать в себя весь нанобар в центре, и добавьте к эксперименту области. Входные параметры изображения TimeLapse. Выберите Временные ряды.
Затем нажмите кнопку Длительность. Выберите 100 циклов и интервал, равный двум секундам. Входные параметры отбеливания.
Установите флажки лазера, выполняющие FRAP, и измените питание на 100%Нажмите кнопку Начать эксперимент для эксперимента FRAP. Загрузите белковый раствор в канал PDMS и инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы обеспечить связывание белка на SLB. Перефокусируйте нанобары и задайте параметры сканирования для получения изображений как липидных, так и белковых каналов для обнаружения искривления белка.
Выберите области эксперимента и проведите анализ FRAP как на липидном, так и на белковом каналах, а также выполните визуализацию TimeLapse для характеристики подвижности белка, чувствительного к кривизне. Оба показывают повышенное накопление на конце SLB покрытых отдельных нанобаров шириной 300 нанометров. Здесь SLB содержит 10% PS для электростатического усиления связывания с белками.
Оба белка имеют более высокое отношение конца к центру, чем липиды, которое составляет около единицы. При сравнении IDR FBP17 и F-Bar более высокое отношение конца к центру IDR FBP17 указывает на более сильное измерение кривизны, чем F-Bar. Все три белка показали преимущественное накопление на нанобарных концевых изогнутых мембранных участках, когда кривизна уменьшилась ниже 400 нанометров в диаметре.
Среди этих трех белковых доменов IDR FBP17 дает самый высокий нанобар и плотность, что указывает на его самую сильную способность к восприятию кривизны, в то время как F-Bar показывает самое низкое значение. Кривая связывания белка может быть построена путем постепенного увеличения концентрации белка, что показывает, что IDR FBP17 обладает сильной способностью к совместному восприятию кривизны. По сравнению с быстрым восстановлением липидных сигналов на нанобарах, F-Bar не может восстановиться в течение двух минут, что свидетельствует о его значительном снижении подвижности мембраны и ассоциативной динамики на изогнутых участках мембраны.
Удивительно, но в отличие от поведения F-Bar, сигналы IDR FBP17 показали очевидное восстановление в течение того же периода времени, что указывает на динамический характер IDR FBP17, накопленный на изогнутых мембранах. Однако после смывания несвязанного IDR FBP17 в растворе такое же восстановление в канале IDR FBP17 не могло наблюдаться, как раньше. Качество SLB очень важно при изучении взаимодействия между изогнутой мембраной и белком.
Таким образом, тест FRAP необходим в нашем эксперименте для проверки подвижности мембраны. Эта система поможет исследователям изучить различные параметры, влияющие на взаимодействие белка с изогнутой мембраной, такие как домены, чувствительные к кривизне, и липидный состав, а также провести динамические исследования изогнутой мембраны, такие как поведение разделения лица.
