用于鉴定抗体依赖性细胞毒性修饰化合物的高内涵筛选检测

抗体依赖性细胞毒性，简称ADCC，可以由自然杀伤细胞介导，我们称之为NK细胞，粒细胞和巨噬细胞。这些是ADCC的效应细胞。如果靶向表皮生长因子受体HER2的抗体如曲妥珠单抗与肿瘤细胞结合，则这些效应细胞使用其FcyR受体结合抗体的恒定FC区域。

抗体桥接肿瘤细胞和携带FcyR受体的效应细胞，触发其细胞毒性颗粒的释放。这导致癌细胞凋亡。ADCC可能对曲妥珠单抗抗增殖作用无反应的肿瘤有效。

为了建立ADCC系统，我们需要在抗HER2抗体曲妥珠单抗存在下，将抗HER2阳性JIMT-1乳腺癌细胞与NK-92细胞系共同孵育。我们用于测定的JIMT-1细胞系稳定地表达绿色荧光蛋白。首先，用JIMT培养基对96孔高内涵筛选板进行编码。

将50微升培养基移液到板的每个孔中。将板放入 CO 2 培养箱中一小时。涂层对于将JIMT-1细胞附着到板的玻璃表面至关重要。

在包被步骤中，胰蛋白酶消化JIMT-1细胞。用两毫升无菌PBS洗涤细胞。然后，向烧瓶中加入一毫升胰蛋白酶-EDTA。

将烧瓶放回 CO 2 培养箱中 10 分钟。孵育后，点击烧瓶以检查JIMT-1细胞是否已脱落。用两毫升JIMT-1培养基停止消化，并将细胞悬液收集到15毫升管中。

然后，在蓝色铸造室中用台盼蓝计数 JIMT-1 细胞。将细胞数调整为每毫升133， 000个细胞。吸出包衣培养基，然后向每个孔中加入75微升细胞悬液。

让细胞在 CO2 培养箱中以 37 摄氏度孵育过夜期间附着。第二天，吸出培养基并向孔中加入50微升新鲜的JIMT-1培养基，并将板转移到高通量筛选实验室。机器人用于将测试化合物转移到高内涵筛选微孔板上。

通过机械臂，机器人抓住销工具单元，该单元经过校准以传输 25 纳升。分四个步骤将总共100纳升的测试化合物从化合物库板转移到测定板上。确保测试化合物的最终浓度为20微摩尔。

在每个步骤之间，首先在50%DMSO中清洗销钉工具，然后在70%乙醇中清洗。将板在 37 摄氏度的 CO2 培养箱中孵育一小时。在T25组织培养瓶中培养NK细胞。

在JIMT-1细胞的药物治疗正在进行时，将NK细胞从T25烧瓶中收集到15毫升离心管中。在蓝色计数室中用台盼蓝计数NK-92细胞。将细胞数调整为每毫升 400， 000 个细胞。

在室温下以150g离心每毫升含有400， 000个细胞的NK细胞悬液体积3分钟。通过在 JIMT-1 培养基中加入每毫升抗 HER2 抗体曲妥珠单抗 20 微克来制备 ADCC 培养基。将20， 000 NK细胞移液于50微升ADCC培养基中至目标JIMT-1 GFP细胞。

最终体积为100微升，最终曲妥珠单抗浓度为每毫升10微克。将测定板放入高内涵分析设备中，该设备具有内置培养箱设置37摄氏度。板在两个时间点成像。

首先，我们在将效应细胞添加到目标细胞后立即获取图像，并在添加NK细胞后三小时拍摄第二组图像。首先，选择微孔板的类型。使用 96 孔高内涵筛选板。

选择以选择焦点，因为该测定是在非共聚焦模式下以10倍物镜的平板中进行的。选择合并二可使信噪比加倍。选择合适的通道、曝光时间、激光功率、焦平面和波长。

获取650-760纳米的明场图像，并检测具有488纳米激发和500-550纳米发射波长的EGFP转导的JIMT-1细胞。在开始测量之前，请使用快照功能拍摄样本图像，以检查正确的设置。最后，设置映像的字段数和时间点数。

例如，选择九个字段和两个时间点。为了分析ADCC效率，请计数对照ADCC孔中的活JIMT-1细胞。使用精细细胞模块检测图像上与细胞对应的区域。

将每个细胞检测为图像上荧光强度高于其周围环境的区域。使用直径为 80 微米的内置 M 算法选择细胞。将拆分敏感度设置（将大型对象划分为较小对象）设置为值 0.5。

将公共阈值（即像素强度的最低级别）调整为零。分两步排除具有高EGFP荧光强度的背景区域的检测。首先，应用计算强度属性函数来确定先前选择的细胞区域中的EGFP荧光强度。

然后，使用选择群体选项设置最小和最大强度阈值，以便我们在ADCC结束时获得活的JIMT-1 GFP靶细胞的数量。通过将三小时后检测到的细胞数除以在时间零处检测到的细胞数来计算ADCC效率。我们想用具有代表性的结果来展示我们方法的实际应用。

我们设置了一个测试板，其中随机从货架上取下了 16 种化合物。我们还纳入了三种化合物，秋水仙碱、长春新碱和鬼臼毒素，具有预期的ADCC抑制作用。DMSO用作阴性对照。

每种药物在平板上重复使用四次。该图显示了测试屏幕的结果。在负NK组中，测试药物对JIMT-1细胞的毒性。

在加NK组中，加入NK细胞和曲妥珠单抗，引起约50%的细胞毒性。三种测试化合物的预期ADCC抑制剂作用可以通过测定法检测到。我们已经建立了一个共培养测定系统，模拟乳腺癌细胞、NK细胞和治疗性单克隆抗体曲妥珠单抗之间的临床相关相互作用。

该测定基于自动显微镜结合图像分析，适用于筛选化合物库以鉴定ADCC修饰药物。该程序可用于识别增强抗肿瘤反应的佐剂分子或鉴定具有不良反应的化学物质。