使用微泡从人外周血单核细胞样品中分离、活化和扩增基于浮选的 T 细胞

微泡活化和扩增方案意义重大，因为它解决了细胞疗法研究和制造中未满足的主要需求，提高了T细胞疗法的持久性和疗效。Akadeum基于浮力的正选择、激活和扩增技术限制了激活和扩增工作流程期间的过度刺激和随后的T细胞衰竭。首先，用生物素化的抗CD3抗体在2.5毫升分离缓冲液中孵育3次10至第8个商业获得的PBMC。

通过移液轻轻混合组分，并在室温下孵育10分钟。根据制造商的说明，以0.5:1的比例将剥离的亲和素微泡添加到细胞中。并使用商用端到端旋转器在室温下以 20 RPM 混合 10 到 15 分钟。

在室温下以400g离心5分钟。离心后，阳性选择的细胞将位于悬浮液的顶部，带有剥离的亲和素微泡，剩余的未选择细胞将位于管底部的细胞沉淀中。使用9英寸玻璃移液器，将气泡细胞层下方的吸头插入管底部。

用电动移液管吸出细胞沉淀和清液，并将它们转移到新管中。将留在原始管中的气泡细胞层重悬于一毫升完整的T细胞培养基中。将下清液在室温下以400g离心5分钟，并用于间接测量纯度和回收率。

离心亚清液和未选择的细胞后，吸出上清液，并在计数前将沉淀重悬于一毫升培养基中。使用自动细胞计数器，用明场显微镜计数清液中的细胞，并确定气泡细胞层中捕获的细胞数量，如文本手稿中所述。为了产生偶联的抗CD28剥离的亲和素和微泡，将生物素化的抗CD28抗体添加到商业微泡中，并使用端到端旋转混合至少两个小时。

将抗CD28偶联链球菌亲和素微泡以1.5:1的比例添加到制备的泡泡细胞悬液中。使用端到端旋转混合组分 15 分钟。然后用完整的T细胞培养基或根据获得的细胞数将总体积调节至每毫升200万个细胞。

在24孔板中分配一毫升活化细胞，并在37摄氏度的加湿5%二氧化碳培养箱中孵育。24小时后，加入IL-2和可溶性抗CD3以促进进一步扩增，使用第0天接种的初始细胞数计算。将细胞板放回加湿的二氧化碳培养箱中，并在37摄氏度下孵育过夜。

每两天从中钠中取出一半的培养基。用新鲜，完整的T细胞培养基代替，并以每毫升50单位的浓度加入IL-2。每周两次计数T细胞以评估细胞密度。

当细胞密度超过每毫升2乘以10至第6个细胞，或2.5乘以10至第6个细胞时，将它们转移到更大的容器中，将它们稀释至每毫升5乘以10至第5个细胞。通过上下移液轻轻混合每个孔的内容物。取出孔的全部内容物，包括微气泡，并将它们转移到1.5毫升管中。

用400微升无钙和无镁DPBS洗涤每个孔，并将溶液转移到1.5毫升管中。然后在室温下以400g离心管5分钟。吸出上清液，并将细胞沉淀重悬于50微升分离缓冲液中。

接下来，将50微升细胞悬液分成25微升，用于活化和耗尽。用活化和耗尽抗体染色混合物对细胞进行染色，并在室温下在黑暗中孵育10分钟。加入一毫升分离缓冲液，轻轻混合，离心以洗去多余的抗体。

完全吸出上清液。将细胞沉淀重悬于一毫升分离缓冲液中，并将其转移到适当的容器中进行流式细胞术分析。在对照样品和接受微气泡共刺激的细胞之间观察到活T细胞数量和转基因阳性T细胞的增加。

在微气泡样品中也观察到效应细胞群增加。活活化的T细胞表达增加的早期活化标志物CD69和中晚期活化标志物CD25。在接受微气泡共刺激的细胞样品中，耗尽标志物PD1阳性细胞的总数和百分比也显着更高。

微气泡的正确混合和分配对于确保准确的剂量至关重要，因为微气泡会快速漂浮到表面而不会搅拌。我们完全期望它通过使大量T细胞的快速生长具有比其他方法中常见的更疲惫的T细胞更高的活性来做到这一点。