פרוטוקול ההפעלה וההרחבה של microbubble הוא משמעותי מכיוון שהוא נותן מענה לצורך מרכזי שטרם קיבל מענה במחקר וייצור של טיפול בתאים, ומשפר את ההתמדה והיעילות של טיפולים בתאי T. טכניקת הבחירה, ההפעלה וההרחבה החיובית, המבוססת על ציפה של Akadeum מגבילה גירוי יתר ותשישות תאי T לאחר מכן במהלך תהליכי עבודה של הפעלה והרחבה. כדי להתחיל, לדגור 3 פעמים 10 ל 8 מתקבל באופן מסחרי PBMCs ב 2.5 מיליליטר של חיץ הפרדה, עם נוגדן anti-CD3 biotinylated.
מערבבים בעדינות את הרכיבים על ידי פיפטציה, ודוגרים אותם בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. הוסיפו לתאים מיקרו-בועות אבידין מופשטות ביחס של 0.5 ל-1, בהתאם להוראות היצרן. ומערבבים באמצעות סיבוב מסחרי מקצה לקצה ב-20 סל"ד למשך 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר.
צנטריפוגה ב-400 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר צנטריפוגה, התאים שנבחרו באופן חיובי יהיו בחלק העליון של ההשעיה עם המיקרו-שבבים של אבידין מופשטים, והתאים הנותרים שלא נבחרו יהיו בכדור התא בתחתית הצינור. באמצעות פיפטה זכוכית בגודל תשעה אינץ ', הכנס את הקצה שמתחת לשכבת תאי הבועה לתחתית הצינור.
לשאוף את כדור התא ואת subnatant עם פיפטה אלקטרונית, ולהעביר אותם צינור חדש. השהה את שכבת תא הבועה שנותרה בצינור המקורי במיליליטר אחד של מדיום תאי T שלם. צנטריפוגה של subnatant ב 400g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ולהשתמש בו למדידה עקיפה של טוהר והתאוששות.
לאחר צנטריפוגה של התאים התת-קרקעיים והלא נבחרים, שאפו את הסופרנטנט, והניחו מחדש את הכדור במיליליטר אחד של מדיה לפני הספירה. באמצעות מונה תאים אוטומטי, יש לספור את התאים בתת-התא באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר ולקבוע את מספר התאים שנלכדו בשכבת תאי הבועה, כפי שמתואר בכתב היד של הטקסט. כדי ליצור את ה-anti-CD28 המצומד עם אבידין ומיקרו-בועות, הוסיפו את הנוגדן הביוטינילי נגד CD28 לבועות המיקרו המסחריות, וערבבו באמצעות סיבוב מקצה לקצה למשך שעתיים לפחות.
הוסיפו את בועות המיקרו המצומדות נגד CD28 של סטרפ אבידין לתרחיף תא הבועה המוכן ביחס של 1.5 ל-1. מערבבים את הרכיבים בעזרת סיבוב מקצה לקצה במשך 15 דקות. לאחר מכן התאם את הנפח הכולל ל -2 מיליון תאים למיליליטר עם מדיום תאי T שלם, או מדיום רצוי אחר בהתאם למספר התא המתקבל.
מפיצים מיליליטר אחד של תאים פעילים בצלחת של 24 בארות, ודוגרים באינקובטור לח של 5% פחמן דו חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר 24 שעות, הוסף IL-2 ואנטי-CD3 מסיס כדי לעודד התרחבות נוספת, כפי שחושב באמצעות המספר ההתחלתי של תאים מצופים ביום אפס. החזירו את לוחית התא לחממת הפחמן הדו-חמצני הלחות, ודגרה למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
מוציאים מחצית מהמדיום מהמדיום כל יומיים. החלף אותו במדיום טרי ושלם של תאי T, והוסף IL-2 בריכוז של 50 יחידות למיליליטר. ספרו את תאי ה-T פעמיים בשבוע כדי להעריך את צפיפות התאים.
כאשר צפיפות התאים עולה על 2 כפול 10 ל -6, או 2.5 פעמים 10 לתאים 6 למיליליטר, העבר אותם לכלי גדול יותר, דילול אותם ל -5 פעמים 10 לתאים 5 למיליליטר. מערבבים בעדינות את תכולת כל באר על ידי צנרת למעלה ולמטה. הסר את כל התוכן של הבאר, כולל microbubbles, ולהעביר אותם לתוך צינור 1.5 מיליליטר.
לשטוף כל באר עם 400 microliters של DPBS ללא סידן ומגנזיום, ולהעביר את התמיסה לתוך צינור 1.5 מיליליטר. לאחר מכן צנטריפוגה של הצינור ב 400 גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לשאוף את supernatant, ו להשעות את כדור התא ב 50 microliters של חיץ הפרדה.
לאחר מכן, חלקו 50 מיקרוליטרים של תרחיף תאים ל-25 מיקרוליטרים כל אחד לצורך הפעלה ותשישות. הכתימו את התאים בקוקטייל מכתים נגד הפעלה ותשישות, ודגרו אותם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. מוסיפים מיליליטר אחד של חיץ הפרדה, מערבבים בעדינות וצנטריפוגה כדי לשטוף נוגדנים עודפים.
שאפו את הסופר-נאטנט לחלוטין. להשעות את כדור התא במיליליטר אחד של חיץ הפרדה, ולהעביר אותו לכלי מתאים לניתוח ציטומטריה זרימה. נצפו עליות במספר תאי T בני קיימא ותאי T חיוביים טרנסגנים בין דגימת הביקורת לבין התאים שקיבלו גירוי משותף של מיקרו-בועות.
אוכלוסיות תאי השפעה מוגברות נצפו גם בדגימות המיקרו-בועות. תאי ה-T המופעלים באופן בר-קיימא מבטאים סמן הפעלה מוקדמת מוגבר CD69, וסמן הפעלה בינוני עד מאוחר CD25. המספר הכולל והאחוז של סמני התשישות תאים חיוביים PD1 היו גבוהים יותר באופן משמעותי גם בדגימות תאים שקיבלו גירוי משותף של microbubble.
ערבוב וחלוקה נכונים של מיקרו-בועות חיוניים כדי להבטיח מינון מדויק, שכן המיקרו-בועות צפות אל פני השטח במהירות ללא תסיסה. אנו מצפים לחלוטין שהוא יעשה זאת על ידי מתן אפשרות לצמיחה מהירה של אוכלוסייה גדולה של תאי T עם פעילות גבוהה יותר מאשר תאי T מותשים יותר שנראים לעתים קרובות בשיטות אחרות.
