传染性单核细胞增多症儿童外周血样本中免疫细胞亚群的分离

该方法将能够表征IM个体处于相同疾病状态的不同免疫细胞，这将扩展我们对EBV感染机制的理解。演示该程序的将是来自我们实验室的医生张琳琳。首先，将先前分离的PBMC置于1.5毫升微量离心管中，并在室温下以300G旋转10分钟。

弃去上清液，并用80微升制备的缓冲液重新悬浮细胞。接下来，向细胞悬液中加入20微升CD 14微珠，通过移液充分混合，并将管在冰上孵育15分钟。然后使用一毫升缓冲液洗涤PBMC，并在室温下以300G离心10分钟。

弃去整个上清液，并用500微升缓冲液重新悬浮细胞。对于磁分离，将一根色谱柱放在磁珠分离器上，然后用三毫升缓冲液洗涤色谱柱。接下来，将细胞悬液添加到列中。

让它通过，并将未标记的细胞收集到15毫升离心管中。用三毫升缓冲液洗涤柱三次，并将整个流出物收集在15毫升离心管中。现在，将色谱柱放入新的15毫升离心管中，并向色谱柱中加入5毫升缓冲液。

将柱塞牢固地推入色谱柱中，将磁性标记的细胞冲洗到管中。将磁性标记的细胞以300 G离心五分钟。除去上清液后，将细胞重新悬浮在500微升PBS中，并将细胞悬液转移到1.5毫升微量离心管中进行后续转录组测序。

通过以300G离心5分钟来沉淀收集的未标记细胞，并将细胞重新悬浮在1.5毫升微量离心管中的100微升PBS中。然后，向细胞悬液中加入两微升每种标记的抗体，并在冰上孵育30分钟，避光。接下来，将100微升PBMC细胞悬液等分到1.5毫升微量离心管中，以设置阴性对照样品CD 3，CD 4，CD 8和CD 19，单染色样品和CD 56或CD 16染色样品。

然后向每个试管中加入两微升相应的荧光标记抗体，并在冰上孵育30分钟，避光。孵育后，如前所述用PBS洗涤所有细胞，并重新悬浮在500微升PBS中。打开细胞分选系统，然后运行开机程序。

然后，安装85微米喷嘴，并打开分拣流。将分拣电压设置为 4， 500 伏，将频率设置为 47。在断路窗中将间隙设置为8，开启最佳点自动分选模式，自动确定液滴振幅值。

最后，在侧流窗口中将液滴延迟调整为 30.31。使用前向散射点图与侧向散射点图，绘制多边形门 P1 以识别完整的淋巴细胞群。接下来，使用前向散点面积与高度点图，绘制多边形门 P2 以标识单个像元，并排除双峰。

然后使用CD 19 FITC面积与CD 3每个CPCY 5.5面积点图，绘制矩形门P3以选择CD 3阳性T细胞和CD 19阳性B细胞。接下来，使用CD 4 APCCY 7区域与CD 8 PE区域点图，绘制矩形门以选择CD 4和CD 8阳性T细胞。最后，使用侧散射区域与CD 56或CD 16 APC面积点图，绘制矩形门以选择CD 56或CD 16阳性自然杀伤细胞。

对于阴性对照管，单击采集仪表板中的加载，然后在软件中选择细胞仪设置。在检查器窗口中，单击参数选项卡，然后调整正向散射、侧向散射和不同荧光染料的电压。将单染色管装入细胞仪后，单击采集仪表板中的加载，然后单击补偿选项卡以调整补偿，如文本中所述。

轻轻涡旋细胞悬液，然后将试管装入细胞仪。将200微升FBS加入四个收集流管中，并涡旋管。将它们放入细胞仪收集室中。

在四个流管中分别收集不同类型的细胞。将分离的细胞以 300 G 离心五分钟，然后将 200 μL RNA 分离试剂添加到细胞调色板中以进行转录组测序。本研究采用免疫磁珠和荧光活化细胞分选技术，从不同样本的外周血中高效分选免疫细胞亚群。

重要的是，在该协议中，细胞分选步骤已经过优化以提高细胞活力。与健康的EB病毒携带者和未感染的样本相比，分选的免疫细胞显示传染性单核细胞增多症患者中CD3，CD 8阳性T细胞的比例增加。相比之下，与健康EBV携带者和未感染EBV的儿童相比，在传染性单核细胞增多症患者中观察到CD 3，CD 4阳性T细胞和CD 19阳性B细胞的比例降低。

此外，与未感染EBV的儿童相比，在传染性单核细胞增多症患者中观察到CD 56或CD 16阳性自然杀伤细胞的比例降低。保持细胞活力对于后续实验至关重要。在分选过程中将细胞保存在冰上或冰箱中有利于细胞活力。