该协议提供了一种明确的方法来使用ACHI模型从r-mTBI施用的动物中生产高质量的横向海马切片。ACHI模型会产生轻微伤害。它不涉及颅骨骨折或出血、开颅或使用麻醉剂。
此外，它还允许稳定的电生理记录。这些技术允许研究重复MTBI后突触可塑性的变化，其病因非常未知，并有可能为治疗途径提供信息。演示该程序的将是我实验室的硕士生Allyson Gross和博士后研究员Eric Eyolfson博士。
首先将大鼠放在约束锥中，确保鼻子和鼻孔靠近锥体小开口以允许充分通风。通过用塑料发夹将锥体封闭在尾端来防止大鼠移动。手动将头盔放置在被约束的大鼠的中线上，靶向盘位于左顶叶上。
接下来，将大鼠放在泡沫垫上，然后手动将冲击器设置为延伸位置。手动降低撞击器尖端以接触头盔上的目标盘。然后将撞击器设置为缩回位置，使撞击器在头盔上方 10 毫米处撤回。
使用立体定位臂上的拨盘，将冲击尖端降低 10 毫米，以再次触摸头盔上的瞄准盘。然后，拨动冲击开关，使动物的头部以每秒 6 米的速度快速加速 10 毫米。一旦设备被激活，立即将动物从约束锥中取出，以立即执行神经学评估方案或NAP。
对小鼠实施安乐死后，解剖大脑并将其放在倒置培养皿上的湿滤纸上。使用锋利的手术刀，去除小脑和前额叶皮层以吸干大脑。通过削减大脑中线来分隔两个半球。
要创建横向海马切片，请将一个半球放在内侧表面，将手术刀向内倾斜约 30 度，并从大脑背表面取出薄片，以提供用于安装在活塞上的平坦表面。将大脑翻转到背表面，在干燥的滤纸上轻轻轻拍脑组织以去除多余的ACSF。然后，使用氰基丙烯酸酯胶将大脑的背表面连接到活塞上，使腹面直立。
将活塞的外管伸到大脑上，将液体琼脂糖倒入管中，直到大脑完全覆盖。通过将冷却块夹在活塞管上来快速固化琼脂糖。将活塞放入切片机的腔室中，并用螺钉固定腔室。
固定刀片后，将冰冷的含氧ACSF添加到切片机室中。在切片机上，将切割速度设置为 4，振荡设置为 6，并将连续单切片开关切换为连续。然后，按“开始”开始在 400 微米处切割大脑。
当切片机切片大脑时，使用大直径巴斯德移液管将每个切片转移到含氧ACSF的恢复浴中。让切片在 32 摄氏度下恢复 30 分钟，然后在室温下再恢复 30 分钟。重复这些步骤以从第二个半球创建切片。
使用市售的微量移液器拉拔器，从外径为1.5毫米，内径为1.1毫米的10厘米硼硅酸盐玻璃毛细管中拉出1至2兆欧的记录电极。使用巴斯德移液管，将海马切片从恢复浴转移到注入碳化ACSF并保持在30摄氏度的腔室中。定向脑切片，使齿状回和颗粒细胞层在视野中可见。
使用正置显微镜用斜光学元件观察齿状回。定位同心双极刺激电极以激活分子层中间三分之一的内侧穿孔路径或MPP纤维。然后，将充满ACSF的玻璃微量移液器放置在MPP中。
从电极开始，因为接触组织会损坏纤维。一旦刺激和记录电极被定位，使用放大器、数字化仪和记录软件可视化诱发场响应。通过用电流脉冲刺激组织并确保最小振幅为 0.7 毫伏，并且透明纤维凌空小于场 EPSP，找到合适的场兴奋性突触后电位或场 EPSP。
增加并设置模拟强度，直到场 EPSP 达到最大振幅的 70%。接下来，建立 20 分钟的稳定预处理基线，以 0.067 赫兹提供 0.12 毫秒脉冲。对于稳定切片，fEPSP 的初始斜率应小于 10% 变异性，并且通过标绘场 EPSP 斜率的最佳拟合线的斜率应小于 0.5。
使用配对脉冲刺激和构建刺激/响应输入/输出曲线来确定基本突触特性的变化。对于配对脉冲测试，在 0.033 赫兹下应用一系列脉冲间隔为 50 毫秒的配对脉冲。对于输入/输出曲线，在 0.033 赫兹下应用一系列从 0.0 到 0.24 毫秒的递增激励强度，以绘制场 EPSP 响应大小变化。
为了研究主要依赖于CB1受体激活的长期抑郁症，请在10赫兹下使用6， 000个脉冲。对于后调节记录，使用0.12毫秒的单脉冲刺激以0.067赫兹的频率再恢复60分钟。在后调节记录之后，施用配对脉冲刺激，然后是输入/输出曲线。
将这些与基线记录与观察到的突触前释放特性变化进行比较，并评估切片的健康状况以进行长期记录。在分析过程中，请遵循排除标准来确定突触前可塑性数据集中各个切片的数据保留。排除在预处理基线期间在现场 EPSP 斜率的最佳拟合线、预处理基线中的不稳定以及条件后期间的不稳定性中显示大斜率的切片。
在基线时，神经学评估方案或NAP评分显示假和重复mTBI大鼠之间没有差异。在所有清醒闭合性头部损伤会议之后，与假鼠相比，重复的mTBI大鼠在NAP任务中表现出显着的损害，表明产生了微妙但显着的行为缺陷。施用一系列成对脉冲，并计算第二场EPSP的大小相对于第一场EPSP的大小之比。
假和重复mTBI大鼠之间的配对脉冲比没有差异，表明重复mTBI大鼠没有改变齿状回MPP输入中的基本突触生理学。当施用 10 赫兹方案诱导长期抑郁时，齿状回的 MPP 输入能力暂时但显着降低，以维持损伤后第一天的长期抑郁。然而，到受伤后第七天，假手术和重复mTBI动物的切片显示出相同的长期抑郁，尽管有迹象表明重复mTBI动物表现出长期抑郁增加的轻微趋势。
提前规划解剖和切割过程对于成功创建可行的海马切片和获得稳定的电生理记录至关重要。该程序创建了一个稳定的实验平台，可用于检查TBI病理生理学并开发新的治疗途径。从取出大脑到将其定位以切入横向海马切片的压缩膜的运动很重要，电极在齿状回中的准确放置也很重要。
