Этот протокол обеспечивает четкий метод получения высококачественных поперечных срезов гиппокампа от животных, которым вводили r-mTBI, с моделью ACHI. Модель ACHI дает легкие травмы. Это не связано с переломами черепа или кровотечениями, трепанацией черепа или использованием анестетика.
Кроме того, это позволяет проводить стабильные электрофизиологические записи. Эти методы позволяют исследовать изменения синаптической пластичности после повторного MTBI, этиология которых в значительной степени неизвестна, с потенциалом для информирования терапевтических путей. Продемонстрируют процедуру Эллисон Гросс, студентка магистратуры моей лаборатории, и доктор Эрик Эйолфсон, докторант.
Начните с помещения крысы в удерживающий конус, убедившись, что морда и ноздри находятся близко к маленькому отверстию колбочек, чтобы обеспечить достаточную вентиляцию. Предотвратите движение крысы, удерживая конус закрытым на каудальном конце пластиковой заколкой для волос. Вручную наденьте шлем на среднюю линию сдерживаемой крысы так, чтобы прицельный диск находился над левой теменной долей.
Затем поместите крысу на поролоновую подушку, прежде чем вручную установить ударник в положение выдвижения. Опустите наконечник ударного элемента вручную, чтобы соприкоснуться с целевым диском на шлеме. Затем установите ударный элемент в положение втягивания, чтобы ударный элемент поднялся на 10 миллиметров над шлемом.
С помощью циферблата на стереотаксической руке опустите ударный наконечник на 10 миллиметров, чтобы снова коснуться диска наведения на шлеме. Затем переключите ударный выключатель так, чтобы голова животного быстро разогналась со скоростью шесть метров в секунду на 10 миллиметров. Как только устройство активировано, немедленно извлеките животное из удерживающего конуса, чтобы выполнить немедленный протокол неврологической оценки или NAP.
После усыпления мыши препарируйте мозг и поместите его на смоченную фильтровальную бумагу на перевернутой чашке Петри. С помощью острого скальпеля удалите мозжечок и префронтальную кору, чтобы промокнуть мозг. Разделите два полушария, сократив среднюю линию мозга.
Чтобы создать поперечные срезы гиппокампа, поместите одно полушарие на медиальную поверхность, наклоните скальпель примерно на 30 градусов внутрь и удалите тонкий срез с дорсальной поверхности мозга, чтобы обеспечить плоскую поверхность для установки на поршень. Переверните мозг на дорсальную поверхность и аккуратно промокните мозговую ткань сухой фильтровальной бумагой, чтобы удалить излишки ACSF. Затем прикрепите дорсальную поверхность мозга к поршню с помощью цианакрилатного клея, оставив вентральную поверхность в вертикальном положении.
Протяните внешнюю трубку поршня над мозгом и налейте жидкость агарозы в трубку до тех пор, пока мозг полностью не покроется. Быстро затвердейте агарозу, зажав охлаждающий блок над трубкой поршня. Поместите поршень в камеру слайсера и закрепите камеру винтом.
Закрепив лезвие, добавьте в камеру слайсера ледяной кислород ACSF. На слайсере установите скорость резки на четыре, колебания на шесть и переключите переключатель непрерывной одиночной нарезки в положение «Непрерывная». Затем нажмите кнопку «Пуск», чтобы начать разрезание мозга на 400 микрометрах.
Когда слайсер разрезает мозг, используйте пипетку Пастера большого диаметра, чтобы перенести каждый ломтик в ванну для восстановления оксигенированного ACSF. Дайте ломтикам восстановиться при температуре 32 градуса Цельсия в течение 30 минут, а затем оставьте их восстанавливаться еще на 30 минут при комнатной температуре. Повторите эти шаги, чтобы создать срезы из второго полушария.
Используя имеющийся в продаже съемник микропипеток, вытащите записывающие электроды от одного до двух мегаом из 10-сантиметровых капилляров боросиликатного стекла с внешним диаметром 1,5 миллиметра и внутренним диаметром 1,1 миллиметра. Используйте пипетку Пастера и перенесите кусочек гиппокампа из ванны восстановления в камеру, перфузируемую карбогенированным ACSF и поддерживаемую при температуре 30 градусов по Цельсию. Сориентируйте срез мозга так, чтобы в поле зрения были видны зубчатая извилина и слой гранулярных клеток.
Используйте вертикальный микроскоп, чтобы визуализировать зубчатую извилину с косой оптикой. Расположите концентрический биполярный стимулирующий электрод, чтобы активировать медиальный перфорентный путь, или волокна MPP, в средней трети молекулярного слоя. Затем поместите стеклянную микропипетку, заполненную ACSF, в MPP.
Начните с электродов, расположенных дальше друг от друга, так как прикосновение к ткани повредит волокна. После того, как стимулирующие и записывающие электроды расположены, визуализируйте вызванные реакции поля с помощью усилителя, дигитайзера и записывающего программного обеспечения. Найдите подходящий полевовозбуждающий постсинаптический потенциал, или полевой EPSP, стимулируя ткань импульсами тока и обеспечивая минимальную амплитуду 0,7 милливольт с прозрачным волоконным залпом, меньшим, чем поле EPSP.
Увеличьте и установите имитирующую интенсивность до тех пор, пока поле EPSP не достигнет 70% от максимальной амплитуды. Затем установите стабильный базовый уровень предварительного кондиционирования в течение 20 минут с импульсами продолжительностью 0,12 миллисекунды, доставляемыми с частотой 0,067 Гц. Для стабильного среза начальный наклон fEPSP должен быть менее 10% изменчивости, а наклон линии наилучшего соответствия через нанесенные на график наклоны EPSP поля должен быть менее 0,5.
Определите изменения основных синаптических свойств, используя парные импульсные стимулы и построив кривые ввода/вывода стимул/ответ. Для парного импульсного теста примените серию парных импульсов с межимпульсным интервалом 50 миллисекунд при частоте 0,033 Гц. Для кривых ввода/вывода примените серию возрастающих интенсивностей стимулов от 0,0 до 0,24 миллисекунды при 0,033 герц, чтобы построить график изменения размера отклика EPSP поля.
Для изучения длительной депрессии, в первую очередь зависящей от активации рецептора CB1, используйте 6 000 импульсов с частотой 10 герц. Для записи после кондиционирования возобновите ее в течение дополнительных 60 минут, используя одноимпульсную стимуляцию продолжительностью 0,12 миллисекунды с частотой 0,067 герц. После записи после кондиционирования введите парные импульсные стимулы, а затем кривую ввода/вывода.
Сравните их с исходными записями с наблюдаемыми изменениями свойств пресинаптического высвобождения и оцените состояние среза для долгосрочных записей. Во время анализа придерживайтесь критериев исключения для определения удержания данных из отдельных срезов в наборе данных пресинаптической пластичности. Исключите срезы, отображающие большой наклон в линии наилучшего соответствия наклонов EPSP поля в течение исходной линии до кондиционирования, нестабильность в базовой линии до кондиционирования и нестабильность в период после кондиционирования.
На исходном уровне протокол неврологической оценки, или баллы NAP, не показали разницы между фиктивными и повторными крысами mTBI. После всех сеансов травм головы в сознании у крыс с ЧМТ повторные нарушения в задачах NAP по сравнению с притворством, что указывает на то, что были вызваны тонкие, но значительные поведенческие дефициты. Вводили серию парных импульсов и рассчитывали отношение размера второго поля EPSP относительно первого поля EPSP.
Соотношение парных импульсов не различалось между фиктивными и повторными крысами с мЧМТ, показывая, что повторные крысы с мЧМТ не изменяли основную синаптическую физиологию во входе MPP в зубчатую извилину. Когда был введен протокол 10 герц, чтобы вызвать долгосрочную депрессию, наблюдалось временное, но значительное снижение способности входа MPP в зубчатую извилину поддерживать долгосрочную депрессию в первый день после травмы. Тем не менее, к седьмому дню после травмы срезы от фиктивных и повторных животных с мЧМТ показали эквивалентную долгосрочную депрессию, хотя было указание на небольшую тенденцию к тому, что у животных с повторной ЧМТ наблюдалась тенденция к увеличению долгосрочной депрессии.
Заблаговременное планирование процесса вскрытия и разрезания имеет решающее значение для успешного создания жизнеспособных срезов гиппокампа и получения стабильных электрофизиологических записей. Эта процедура создает стабильную экспериментальную платформу, которая может быть использована для изучения патофизиологии ЧМТ и разработки новых терапевтических направлений. Движение от удаления мозга до позиционирования его для разрезания сжатой пленки для поперечных срезов гиппокампа важно, как и точное размещение электродов в зубчатой извилине.
