Este protocolo fornece um método claro para produzir cortes transversais de hipocampo de alta qualidade a partir de animais administrados por r-mTBI com o modelo ACHI. O modelo ACHI produz lesões leves. Não envolve fraturas ou sangramentos cranianos, craniotomias ou uso de anestésico.
Além disso, permite registros eletrofisiológicos estáveis. Essas técnicas permitem a investigação das alterações na plasticidade sináptica após MTBI repetidos, cuja etiologia é amplamente desconhecida, com o potencial de informar caminhos terapêuticos. Demonstrando o procedimento estarão Allyson Gross, mestrando do meu laboratório, e o Dr. Eric Eyolfson, bolsista de pós-doutorado.
Comece colocando o rato em um cone de contenção, garantindo que o focinho e as narinas estejam próximos à pequena abertura dos cones para permitir ventilação adequada. Impedir o movimento do rato mantendo o cone fechado na extremidade caudal com um grampo de cabelo de plástico. Posicione manualmente o capacete sobre a linha média do rato contido com o disco de mira sobre o lobo parietal esquerdo.
Em seguida, coloque o rato sobre a almofada de espuma antes de ajustar manualmente o pêndulo para a posição estendida. Abaixe a ponta do pêndulo manualmente para entrar em contato com o disco alvo no capacete. Em seguida, ajuste o pêndulo para a posição de retração para fazer com que o pêndulo se retire 10 milímetros acima do capacete.
Usando o mostrador no braço estereotáxico, abaixe a ponta de impacto em 10 milímetros para tocar o disco de mira no capacete novamente. Em seguida, gire o interruptor de impacto para que a cabeça do animal seja acelerada rapidamente a seis metros por segundo por 10 milímetros. Uma vez que o dispositivo esteja ativado, remova o animal do cone de contenção imediatamente para realizar um protocolo de avaliação neurológica imediata, ou NAP.
Depois de sacrificar o rato, disseque o cérebro e coloque-o em um papel de filtro molhado em uma placa de Petri de cabeça para baixo. Usando um bisturi afiado, remova o cerebelo e o córtex pré-frontal para manchar o cérebro. Separe os dois hemisférios cortando a linha média do cérebro.
Para criar cortes transversais do hipocampo, coloque um hemisfério na superfície medial, incline o bisturi a aproximadamente 30 graus para dentro e remova uma fatia fina da superfície dorsal do cérebro para fornecer uma superfície plana para montagem no pistão. Vire o cérebro para a superfície dorsal e esfregue suavemente o tecido cerebral em papel de filtro seco para remover o excesso de ACSF. Em seguida, fixe a superfície dorsal do cérebro ao pistão com cola de cianoacrilato, deixando a superfície ventral ereta.
Estenda o tubo externo do pistão sobre o cérebro e despeje a agarose líquida no tubo até que o cérebro esteja completamente coberto. Solidifique rapidamente a agarose apertando um bloco de refrigeração sobre o tubo do pistão. Posicione o pistão na câmara da fatiadora e prenda a câmara com um parafuso.
Depois de fixar a lâmina, adicione ACSF oxigenado gelado à câmara de fatiamento. Na segmentação de dados, defina a velocidade de corte para quatro, a oscilação para seis e alterne o interruptor de fatiamento único contínuo para Contínuo. Em seguida, pressione Start para começar a seccionar o cérebro a 400 micrômetros.
À medida que a fatia separa o cérebro, use uma pipeta de Pasteur de grande diâmetro para transferir cada fatia para o banho de recuperação de ACSF oxigenada. Deixe as fatias recuperarem a 32 graus Celsius durante 30 minutos e depois deixe-as recuperar por mais 30 minutos à temperatura ambiente. Repita essas etapas para criar fatias do segundo hemisfério.
Usando um puxador de micropipetas disponível comercialmente, puxe eletrodos de gravação de um a dois megaohm de capilares de vidro borossilicato de 10 centímetros com diâmetro externo de 1,5 milímetro e diâmetro interno de 1,1 milímetros. Use uma pipeta de Pasteur e transfira uma fatia do hipocampo do banho de recuperação para a câmara sendo perfundida com ACSF carbogenada, e mantida a 30 graus Celsius. Orientar a fatia cerebral de modo que o giro denteado e a camada de células granulares sejam visíveis no campo de visão.
Use um microscópio vertical para visualizar o giro denteado com óptica oblíqua. Posicione um eletrodo estimulador bipolar concêntrico para ativar o caminho perfurante medial, ou fibras MPP, no terço médio da camada molecular. Em seguida, posicione uma micropipeta de vidro preenchida com ACSF no MPP.
Comece com os eletrodos mais afastados, pois tocar o tecido danificará as fibras. Uma vez posicionados os eletrodos de estimulação e gravação, visualize as respostas do campo evocado usando um amplificador, um digitalizador e um software de gravação. Encontre um potencial pós-sináptico excitatório de campo adequado, ou EPSP de campo, estimulando o tecido com pulsos de corrente e garantindo uma amplitude mínima de 0,7 milivolts com um volley de fibra transparente menor que o campo EPSP.
Aumente e ajuste a intensidade de simulação até que o campo EPSP esteja a 70% da amplitude máxima. Em seguida, estabeleça uma linha de base de pré-condicionamento estável por 20 minutos com pulsos de 0,12 milissegundos administrados a 0,067 hertz. Para uma fatia estável, a inclinação inicial da fEPSP deve ser menor que 10% de variabilidade e a inclinação da linha de melhor ajuste através das inclinações EPSP do campo plotado deve ser menor que 0,5.
Determinar as mudanças nas propriedades sinápticas básicas usando estímulos de pulso pareado e construindo curvas de entrada/saída de estímulo/resposta. Para o teste de pulso pareado, aplicar uma série de pulsos pareados com um intervalo de interpulso de 50 milissegundos a 0,033 hertz. Para as curvas de entrada/saída, aplicar uma série de intensidades crescentes de estímulo de 0,0 a 0,24 milissegundos a 0,033 hertz para plotar a mudança de tamanho da resposta EPSP de campo.
Para estudar a depressão de longo prazo dependente principalmente da ativação do receptor CB1, empregar 6.000 pulsos a 10 hertz. Para gravações pós-condicionamento, retome por mais 60 minutos usando estímulos de pulso único de 0,12 milissegundos a uma frequência de 0,067 hertz. Após o registro pós-condicionamento, administrar os estímulos de pulso pareado seguido de uma curva de entrada/saída.
Compare-os com os registros basais com as alterações observadas nas propriedades de liberação pré-sináptica e avalie a saúde do corte para gravações de longo prazo. Durante a análise, aderir aos critérios de exclusão para determinar a retenção de dados de fatias individuais no conjunto de dados de plasticidade pré-sináptica. Excluir fatias que apresentem uma grande inclinação em uma linha de melhor ajuste das inclinações de campo EPSP durante a linha de base de pré-condicionamento, instabilidade na linha de base de pré-condicionamento e instabilidade no período de pós-condição.
No início do estudo, o protocolo de avaliação neurológica, ou escores NAP, não mostrou diferença entre ratos com TCEm simulados e repetidos. Após todas as sessões de traumatismo cranioencefálico fechado acordado, os ratos com TCEm repetidos mostraram prejuízos significativos nas tarefas de NAP em comparação com shams, indicando que déficits comportamentais sutis, mas significativos, foram produzidos. Uma série de pulsos pareados foi administrada e a razão do tamanho do segundo campo EPSP foi calculada em relação ao primeiro campo EPSP.
As razões de pulso pareado não diferiram entre ratos com TCm simulado e com TCEm repetido, revelando que ratos com TCEm repetido não alteraram a fisiologia sináptica básica na entrada de MPP para o giro denteado. Quando um protocolo de 10 hertz foi administrado para induzir uma depressão de longo prazo, houve uma diminuição temporária, mas significativa, na capacidade da entrada de MPP para o giro denteado de sustentar depressão de longo prazo no primeiro dia pós-lesão. No entanto, no sétimo dia pós-lesão, fatias de animais com TCEm falso e repetido exibiram depressão equivalente a longo prazo, embora houvesse uma indicação de uma leve tendência para animais com TCEm repetidos exibirem um aumento na depressão de longo prazo.
Planejar o processo de dissecção e corte com antecedência é fundamental para criar cortes viáveis no hipocampo e obter registros eletrofisiológicos estáveis. Esse procedimento cria uma plataforma experimental estável que pode ser usada para examinar a fisiopatologia do TCE e desenvolver novos caminhos terapêuticos. O movimento de remover o cérebro para posicioná-lo para cortar no filme comprimido para cortes transversais do hipocampo é importante, assim como a colocação precisa de eletrodos no giro denteado.
