Questo protocollo fornisce un metodo chiaro per produrre fette di ippocampo trasversale di alta qualità da animali somministrati con r-mTBI con il modello ACHI. Il modello ACHI produce lesioni lievi. Non comporta fratture o sanguinamenti del cranio, craniotomie o l'uso di anestetico.
Inoltre, consente registrazioni elettrofisiologiche stabili. Queste tecniche consentono di studiare i cambiamenti nella plasticità sinaptica a seguito di MTBI ripetuti, per i quali l'eziologia è ampiamente sconosciuta, con il potenziale di informare le vie terapeutiche. A dimostrare la procedura saranno Allyson Gross, uno studente di master per il mio laboratorio, e il Dr.Eric Eyolfson, un borsista post-dottorato.
Inizia con il posizionare il ratto in un cono di contenimento, assicurandoti che il muso e le narici siano vicini ai coni piccola apertura per consentire un'adeguata ventilazione. Prevenire il movimento del ratto tenendo il cono chiuso all'estremità caudale con un fermaglio di plastica. Posizionare manualmente il casco sopra la linea mediana del ratto trattenuto con il disco di puntamento sul lobo parietale sinistro.
Quindi, posizionare il ratto sul tampone di schiuma prima di impostare manualmente il dispositivo d'urto sulla posizione di estensione. Abbassare manualmente la punta del dispositivo d'urto per contattare il disco di destinazione sul casco. Quindi impostare il dispositivo d'urto sulla posizione di ritrazione per far sì che il dispositivo d'urto si ritiri di 10 millimetri sopra il casco.
Utilizzando il quadrante sul braccio stereotassico, abbassare la punta dell'impatto di 10 millimetri per toccare nuovamente il disco di puntamento sul casco. Quindi, ruotare l'interruttore di impatto in modo che la testa dell'animale venga rapidamente accelerata a sei metri al secondo per 10 millimetri. Una volta attivato il dispositivo, rimuovere immediatamente l'animale dal cono di ritenuta per eseguire un protocollo di valutazione neurologica immediato o NAP.
Dopo aver eutanasia il topo, sezionare il cervello e posizionarlo su una carta da filtro bagnata su una capsula di Petri capovolta. Usando un bisturi affilato, rimuovere il cervelletto e la corteccia prefrontale per cancellare il cervello. Separare i due emisferi tagliando la linea mediana del cervello.
Per creare fette di ippocampo trasversali, posizionare un emisfero sulla superficie mediale, inclinare il bisturi a circa 30 gradi verso l'interno e rimuovere una fetta sottile dalla superficie dorsale del cervello per fornire una superficie piana per il montaggio sul pistone. Capovolgere il cervello sulla superficie dorsale e tamponare delicatamente il tessuto cerebrale su carta da filtro asciutta per rimuovere l'eccesso di ACSF. Quindi, attaccare la superficie dorsale del cervello al pistone usando colla cianoacrilica, lasciando la superficie ventrale in posizione verticale.
Estendere il tubo esterno del pistone sopra il cervello e versare l'agarosio liquido nel tubo fino a quando il cervello è completamente coperto. Solidificare rapidamente l'agarosio bloccando un blocco di raffreddamento sul tubo del pistone. Posizionare il pistone nella camera dell'affettatrice e fissare la camera con una vite.
Dopo aver fissato la lama, aggiungere ACSF ossigenato ghiacciato alla camera dell'affettatrice. Sul filtro dei dati, impostare la velocità di taglio su quattro, l'oscillazione su sei e impostare l'interruttore di sezionamento singolo continuo su Continuo. Quindi, premere Start per iniziare a sezionare il cervello a 400 micrometri.
Mentre l'affettatrice seziona il cervello, utilizzare una pipetta Pasteur di grande diametro per trasferire ogni fetta al bagno di recupero dell'ACSF ossigenato. Lasciare recuperare le fette a 32 gradi Celsius per 30 minuti e poi lasciarle recuperare per altri 30 minuti a temperatura ambiente. Ripetete questi passaggi per creare sezioni dal secondo emisfero.
Utilizzando un estrattore di micropipette disponibile in commercio, tirare elettrodi di registrazione da uno a due megaohm da capillari di vetro borosilicato da 10 centimetri con un diametro esterno di 1,5 millimetri e un diametro interno di 1,1 millimetri. Utilizzare una pipetta Pasteur e trasferire una fetta di ippocampo dal bagno di recupero alla camera perfusa con ACSF carbogenato e mantenuta a 30 gradi Celsius. Orientare la fetta del cervello in modo che il giro dentato e lo strato di cellule granulari siano visibili nel campo visivo.
Utilizzare un microscopio verticale per visualizzare il giro dentato con ottica obliqua. Posizionare un elettrodo concentrico bipolare stimolante per attivare il percorso perforente mediale, o fibre MPP, nel terzo centrale dello strato molecolare. Quindi, posizionare una micropipetta di vetro riempita con ACSF nell'MPP.
Inizia con gli elettrodi più distanti, poiché toccando il tessuto danneggerà le fibre. Una volta posizionati gli elettrodi stimolanti e di registrazione, visualizzare le risposte di campo evocate utilizzando un amplificatore, un digitalizzatore e un software di registrazione. Trovare un potenziale postsinaptico eccitatorio di campo adatto, o EPSP di campo, stimolando il tessuto con impulsi di corrente e garantendo un'ampiezza minima di 0,7 millivolt con una raffica di fibre chiare più piccola dell'EPSP di campo.
Aumentare e impostare l'intensità di simulazione fino a quando il campo EPSP è al 70% dell'ampiezza massima. Successivamente, stabilire una linea di base di precondizionamento stabile per 20 minuti con impulsi di 0,12 millisecondi erogati a 0,067 hertz. Per una fetta stabile, la pendenza iniziale del fEPSP deve essere inferiore al 10% di variabilità e la pendenza della linea di migliore adattamento attraverso le pendenze EPSP tracciate deve essere inferiore a 0,5.
Determinare i cambiamenti nelle proprietà sinaptiche di base utilizzando stimoli a impulsi accoppiati e costruendo curve di input/output di stimolo/risposta. Per il test a impulsi accoppiati, applicare una serie di impulsi accoppiati con un intervallo di interimpulso di 50 millisecondi a 0,033 hertz. Per le curve input/output, applicare una serie di intensità di stimolo crescenti da 0,0 a 0,24 millisecondi a 0,033 hertz per tracciare la variazione delle dimensioni della risposta EPSP del campo.
Per studiare la depressione a lungo termine dipendente principalmente dall'attivazione del recettore CB1, impiegare 6.000 impulsi a 10 hertz. Per le registrazioni post-condizionamento, riprendere per altri 60 minuti utilizzando stimolazioni a impulso singolo di 0,12 millisecondi a una frequenza di 0,067 hertz. Dopo la registrazione post condizionamento, somministrare gli stimoli a impulsi accoppiati seguiti da una curva di input / output.
Confronta questi con le registrazioni basali con le alterazioni osservate nelle proprietà di rilascio presinaptico e valuta la salute della fetta per le registrazioni a lungo termine. Durante l'analisi, attenersi ai criteri di esclusione per determinare la conservazione dei dati dalle singole sezioni nel set di dati di plasticità presinaptica. Escludere le sezioni che mostrano una grande pendenza in una linea di adattamento migliore delle pendenze EPSP di campo durante la linea di base di precondizionamento, l'instabilità nella linea di base di precondizionamento e l'instabilità nel periodo post-condizione.
Al basale, il protocollo di valutazione neurologica, o punteggi NAP, non ha mostrato alcuna differenza tra ratti mTBI fittizi e ripetuti. Dopo tutte le sessioni di trauma cranico chiuso svegli, i ratti mTBI ripetuti hanno mostrato menomazioni significative all'interno dei compiti NAP rispetto agli shams, indicando che sono stati prodotti deficit comportamentali sottili ma significativi. È stata somministrata una serie di impulsi accoppiati ed è stato calcolato il rapporto tra la dimensione del secondo campo EPSP rispetto al primo campo EPSP.
I rapporti di impulso accoppiati non differivano tra ratti mTBI fittizi e ripetuti, rivelando che i ratti mTBI ripetuti non alteravano la fisiologia sinaptica di base nell'input MPP al giro dentato. Quando è stato somministrato un protocollo a 10 hertz per indurre una depressione a lungo termine, c'è stata una diminuzione temporanea ma significativa della capacità dell'input MPP al giro dentato di sostenere la depressione a lungo termine il primo giorno post-infortunio. Tuttavia, dal settimo giorno post-infortunio, fette di animali sham e ripetuti mTBI mostravano una depressione equivalente a lungo termine, sebbene vi fosse un'indicazione di una leggera tendenza per gli animali mTBI ripetuti a mostrare un aumento della depressione a lungo termine.
Pianificare in anticipo il processo di dissezione e taglio è fondamentale per creare con successo fette di ippocampo vitali e ottenere registrazioni elettrofisiologiche stabili. Questa procedura crea una piattaforma sperimentale stabile che può essere utilizzata per esaminare la fisiopatologia TBI e sviluppare nuove vie terapeutiche. Il movimento dalla rimozione del cervello al posizionamento per tagliare il film compresso per le fette trasversali dell'ippocampo è importante, così come il posizionamento accurato degli elettrodi nel giro dentato.
