使用改良的夹心 ELISA 定量来自中性粒细胞胞外陷阱的髓过氧化物酶 DNA 和中性粒细胞弹性蛋白酶 DNA 复合物

NETs最近引起了人们的关注，但事实证明，在体内量化NETs具有挑战性。该协议为研究临床环境中NET的特征提供了一种理想的，高度敏感且有价值的方法。该技术应扩展到评估脓毒症或脓毒性ARDS（急性呼吸窘迫综合征）的严重程度。

人们普遍认为，调节倾倒或损伤相关分子模式是改善脓毒症临床状况的关键。该方法的最大优点包括在短时间内准确定量循环NET残余物，如髓过氧化物酶-DNA和中性粒细胞弹性蛋白酶-DNA。建议在测定前旋转样品并避免反复解冻。

遵循方案中给出的孵育时间很重要。首先将新鲜分离的多形核中性粒细胞稀释至每毫升10， 000个细胞，加入不含酚红的RPMI 1640中。将它们筛入35毫米培养皿中。

为了诱导中性粒细胞细胞外陷阱或NET，首先用25纳摩尔PMA刺激多形核中性粒细胞。然后通过加入每毫升0.6微克DNase I来部分消化细胞外陷阱，并将混合物在室温下孵育50分钟。现在，加入五毫摩尔EDTA以停止DNase活性，并收集含有合成NET的培养基。

离心机去除细胞碎片。从四个健康对照中收集上清液。混合将它们存放在零下 80 摄氏度以备进一步使用。

将含有0.05微克抗体的100微升稀释的抗髓过氧化物酶移液到ELISA板中。现在，用粘性塑料盖覆盖板以防止样品蒸发，并将样品在四摄氏度下孵育过夜，以允许捕获抗体结合。第二天，从孔中丢弃稀释的抗体溶液，并将300微升洗涤溶液移入每个孔中。

在纸巾上将盘子擦干以去除多余的PBS。用200微升封闭缓冲液封闭板的每个孔。用粘性塑料盖盖住它，并通过孵育来阻塞孔。

从孔中丢弃封闭溶液并清洗板三到四次后，在纸巾上将其敲干。接下来，将25微升血浆移液到除空白以外的所有孔中。并用75微升PBS稀释，使最终孔容积为100微升。

然后将100微升PBS加入空白孔中。通过在室温下将板放在摇床上以250rpm振荡器10秒钟来混合样品。向所有孔中加入两微升100完全稀释的DNase I，并将密封板放在摇床上10秒钟以彻底混合样品。

在室温下孵育15分钟。向每个孔中加入一微升0.5摩尔EDTA以停止DNase反应。然后将密封板放在摇床上15秒钟，以彻底混合样品。

最后，将板在 4 摄氏度下孵育过夜，以使 NET 的蛋白质组分附着在捕获抗体上。第二天，丢弃井中的溶液。多次洗孔后，将100微升稀释的过氧化物酶偶联的抗DNA检测抗体移入每个孔中。

将板孵育1 1/2小时，然后将溶液丢弃在孔中。洗涤孔三次后，将100微升ABTS底物溶液移液到每个孔中，并在黑暗中将密封板在摇床上孵育。通过加入50微升两摩尔硫酸来停止反应。

通过小心敲击板侧面来混合孔内容物。接下来，将酶标仪连接到计算机并启动软件应用程序。在状态栏中，创建一个新实验并为其命名。

然后通过选择吸光度作为读取类型，终点作为读取模式，两个作为波长来设置板读数参数。接下来，将λ一设置为405纳米，λ二设置为490纳米。现在，选择自动混合和消隐的关闭状态，同时将自动校准保持为开。然后选择条带下的读取整个板。

最后，将列波长优先级设置为正常作为车速，然后在自动读取下选择关闭。将板充分放入仪器抽屉并关闭。单击读取，以便立即读取板。

读取每个孔在405纳米处的吸光度，并从所有未知样品中自动减去测定介质吸光度。当吸光度值分别不超过0.93和0.9时，MPO-DNA和NE-DNA均获得了可靠的标准校准曲线。当施用0.6微克/毫升DNase I时，获得最高的OD。

健康对照中复合物的测定间变异系数分别为1.871和0.987，而COVID-19患者的变异系数分别为2.532和2.010。MPO-DNA和NE-DNA的平均测定间变异系数分别为6.524和4.389。捕获抗体对MPO-DNA和NE-DNA复合物的特异性表明，同种型对照抗体对复合物的反应很小。

相对于健康对照组，COVID-19患者血浆中这两种复合物的百分比更高。应优化脱氧核糖核酸酶消化时间，否则过度消化会降低吸光度。